دانلود رایگان


بررسی تاثیر آلدوسترون در بهبود کیفی جنین های - دانلود رایگان



دانلود رایگان هدف از این مطالعه بررسی تآثیر آلدوسترون در افزایش توانمندی تکاملی تخمک های منجمد شده گوسفند با افزودن آلدوسترون در مرحله بلوغ تخمک و مرحله کشت جنینی می باش

دانلود رایگان
بررسی تاثیر آلدوسترون در بهبود کیفی جنین های حاصل از تخمک های منجمد شده (انجماد شیشه ای) گوسفندچکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تآثیر آلدوسترون در افزایش توانمندی تکاملی تخمک های منجمد شده گوسفند با افزودن آلدوسترون در مرحله بلوغ تخمک و مرحله کشت جنینی می باشد.مواد و روش ها:تخمک های حاصل از تخمدان های کشتارگاهی، بطور تصادفی به شش گروه آزمایشی تقسیم شدند: گروه های یک و دو: بلوغ تخمک های (IVM) منجمد شده و تازه در حضور آلدسترون و متعاقباً لقاح آزمایشگاهی تخمک ها (IVF) و کشت جنین های حاصله (IVC) (به ترتیب گروه هایVit-IVM و IVM). گروه های سه و چهار:IVM و IVF تخمک هایمنجمد شده و تازه، و متعاقباً IVC جنین های حاصله در حضور آلدوسترون در روز چهارم (D4) کشت جنینی (به ترتیب گروه های Vit-D4 و D4). گروه های پنجم و ششم: IVM، IVF و IVC تخمک های منجمد شده ( Vit-Cont) و تازه (Fresh-Cont) بدون حضور آلدوسترون. جنین ها در مراحل مورولا و بلاستوسیت، توسط آنتی بادی های اولیه بر علیه زیر واحدهایα1 و β1پمپ Na+/K+/ATPase رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی شدند.نتایج:میزان تفریخ در گروه هایی که در IVM و یا IVC آنها آلدوسترون افزوده شده بود، در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه (به ترتیب گروه های Vit-IVM، IVM، Vit-D4 و D4) در مقایسه با گروه های کنترل (به ترتیب Vit-Cont. و Fresh-Cont.) به طور معنی داری بیشتر بود. میزان بیان تحت واحد β1پمپ Na+/K+/ATPase، در گروه هایVit-D4 و D4به طور معنی داری بیشتر از سایر گروه های بود. همچنین نسبت ICM/Totalنیز به طور معنی داری در گروهIVMبیشتر از سایر گروه ها بود.بحث: به طور خلاصه، اضافه نمودن آلدسترون به محیط های کشت IVM و IVC می تواند موجب افزایش معنی دار میزان تفریخ در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه گردد. این افزایش میزان تفریخ ممکن است با میزان بیان بیشتر زیر واحد β1پمپ Na+/K+/ATPase، که احتمالاً توسط افزودن آلدوسترون به محیط کشت القا گردیده است، در ارتباط باشد.
کلید واژه:آلدوسترون، گوسفند، جنین،تکامل، Na+/K+/ATPase، بیان
فهرست
عنوان صفحه
خلاصه فارسی1
فصل اول: کلیات
مقدمه 2
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
فصل سوم: مواد و روش­ها
فصل چهارم: نتایج
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
منابع...................................................................................................................................................................... 96
خلاصه انگلیسی..................................................................................................................................................113
فهرست جداول
عنوان صفحه
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
فهرست اشکال
عنوان صفحه
مقدمه و معرفی طرح
در سال­های اخیرعلل مختلفی از قبیل بالا رفتن سن ازدواج، تعییر شیوه زندگی، عوامل عفونی و شیمیایی، اشعه و شیمی درمانی، مسائل ژنتیکی و یائسگی زود رس منجر به ناباروری زوج­های بسیاری شده و لذا انجماد و نگهداری تخمک اقدام اساسی در حفظ قدرت باروری و درمان ناباروری به شمار می­رود. با توجه به ضرورت حفظ و نگهداری تخمک در روش­های کمک باروری[1](ART) تلاش­های زیادی جهت انجماد و نگهداری تخمک­ها صورت گرفته است، لیکن تا­کنون روش قابل اعتمادی در انجماد تخمک که بتواند میزان بالایی از زنده مانی تخمک­ها را نشان دهد گزارش نشده است. علی رغم بررسی های متعدد صورت گرفته بر روی تغییرات مورفولوژیک، فراساختاری، فیزیولوژیک و عملکردی تخمک های منجمد- ذوب شده، هنوز اطلاعات اندكي در خصوص وقوع تغییرات ملکولی و بیوشیمیایی ­ایجاد شده در تخمک های مذکور و نیز الگوی بیان پروتیین های مرتبط با توان تكاملي تخمک ها پس از لقاح، به چشم مي خورد. با توجه به مطرح بودن این گونه حیوانی به عنوان حیوان مدل انسان برای مطالعات تخمدان و تخمک، خطر انقراض برخي از نژادهاي اين گونه جانوري، اهميت اين گونه حيواني از نظر اقتصادي (فراورده هاي دامي)، نقش آن به عنوان بيوراكتور در مطالعات مرتبط با توليد حيوان تراريخته و نيز عدم انجام مطالعه ای در خصوص بررسی ارتباط بين تجویز آلدوسترون و وضعيت بيان آنزیم Na+/K+/ATPaseدر روند تشکیل بلاستوسیست، در مطالعه حاضر به بررسي تاثیرآلدوسترون در بهبود کیفی تخمک های منجمد شده پرداخته خواهد شد.
بدين منظور تخمك هاي استحصال شده از تخمدان هاي كشتارگاهي گوسفند، در مرحله GV از تقسيمات ميوزي به روش کرایوتاپ و با استفاده از روش انجماد شيشه اي منجمد و پس از گذشت يك هفته ذوب شده و پس از لقاح، مراحل تكاملي آنها در شرايط آزمايشگاهي مورد بررسي قرار مي گيرد.
فصل اول
کلیات
1-1- بیان مسئله
با وجود دستیابی به کارآیی نسبتاً بالا در تکنیک های انجماد اسپرم و جنین در پستانداران و از جمله گونه گوسفند، هنوز تکنیک مؤثری به منظور انجماد تخمک های این گونه حیوانی شناسایی نگردیده است. از جمله مهم ترین اهداف انجماد تخمک در نمونه هاي حيواني می توان به حفظ و مدیریت ذخایر ژنتیکی، توسعه علم مهندسی ژنتیک، ارتقای تکنیک انتقال هسته[2](NT)در روند شبیه سازی، تهیه منابع کافی جهت انجام تحقیقات بنیادین، صادرات کم هزینه صفات ژنتیکی برتر و ایجاد بانک تخمك اشاره نمود. علاوه بر این با حفظ و ذخیره سازی طولانی مدت این منابع (تخمك) امکان اعمال برنامه های مدیریتی قویتر در مورد گونه های جانوری در معرض خطر انقراض و در انسان نیز امکان حفظ باروری در زنان در معرض خطر اختلال در عملکرد تخمدان به علت درمانهای خاص (شيمي و پرتو درماني)، جراحی، نارسایی زودرس تخمدان و ... فراهم می گردد؛ ضمن این که انجماد تخمک در نمونه های انسانی هیچ یک از مشکلات و محدودیت های اخلاقی و حقوقی انجماد جنین را نیز به همراه ندارد. مطالعات نشان می دهند که در تخمک های منجمد- ذوب شده، آسیب های فراساختاری، مورفولوژیک، فیزیولوژیک و عملکردی متعددی به چشم مي خورد که مهم ترین آنها عبارتند از: وارد شدن صدمات غیرقابل برگشت به غشاء پلاسمایی تخمك، کاهش نفوذپذیری انتخابی غشاء پلاسمایی، اگزوسیتوز زودرس گرانول های کورتیکال،سفت و سخت شدن زوناپلوسیدا، کاهش شدید میکروویلی ها، بهم ریختگی شدید اووپلاسم، تغییرات شدید و کاهش مشخص دستجات میکروتوبول ها و میکروفیلامان ها، بهم ریختگی دوک تقسیم و حرکت اجزاء اطراف سانتریول ها به مرکز تخمك، خرد شدن هسته، افزایش احتمال پارتنوژنزیس، کاهش شدید فاکتور پیش­برنده میتوز MPF[3]، کاهش مشخص متابوليت ها و پروتئين ها، آنپلوییدی و پلی پلوییدی اشاره نمود.
در این مطالعه به بررسی افزودن برخی عوامل مؤثر در روند اتجماد تخمک مانند آلدوسترون در محیط های اختصاصی کشت جنین و تأثیر آنها بر بیان پروتیین مورد نظر (Na/K ATpase)در مراحل مختلف جنینی
می پردازیم. بديهي است نتايج حاصل از اين مطالعه ضمن مشخص نمودن ميزان تاثير عامل افزوده شده بر روند تکامل تخمك و جنين هاي حاصله از انجماد، امكان ارتقاي كيفي روش هاي انجمادي تخمك مبتني بر نتايج بدست آمده را نه تنها در اين گونه جانوري بلكه در ساير پستانداران از جمله انسان فراهم نموده و بدين ترتيب گامي موثر در جهت رفع معضل تکامل تخمک های انجمادی از مورولا به بلاستوسیست در پستانداران برداشته خواهد شد. لازم به ذکر است تا به حال تأثیر آلدوسترون در روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده گوسفند بررسی نگردیده است و در صورت وجود تأثیر مثبت در این زمینه، موجب تحول روش های انجماد تخمک در گوسفند و حتی سایر گونه ها خواهد شد .
1-2- اهداف پژوهش
1- بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در طی IVM و مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na+/K+/ATPaseموجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا .
2- ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای کیفی(جنین­های حاصله از افزایش میزان تفریخ، ICM/Total) عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده .
1-3- ضرورت انجام تحقیق
این پروژه با هدف پاسخ به برخی از سؤال های زیر طراحی گردید: بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na+/K+/ATPase موجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا؛ بررسی ارتباط بين تجویز هورمون های فعال کننده تحت واحد های 1α و 1β پمپ Na+/K+/ATPase و میزان افزایش عملکرد آنزیم مذکور در مرحله انتقال از مورولا به بلاستوسیست و متعاقباً بهبود روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده و ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده .
1-4- توليد جنين در شرايط In vivo
1-4-1- روند ایجاد سلول جنسی ماده[4]
واحدهاي عملكردي تخمدان فوليكول نام دارند كه تحت سازماندهي سلولي خاص تخمک را در خود جاي داده اند. اين سازماندهي سلولي ثابت نبوده و در طي مراحل مختلف زندگي فوليكول تغييرات پيچيده اي مي يابد. حاصل اين تغييرات به آزاد شدن تخمک[5] و يا تحصيل فوليكول رسيده منجر خواهد شد ]132،54[.
توليد مثل با تكامل تخمك ها در تخمدان آغاز مي گردد. تعداد 1 تا 25 تخمك، بسته به گونه حيوان، در مرحله اي از سيكل جنسي حيوان ماده به نام فاز اوولاسيون[6] از فوليكول تخمداني به داخل حفره شكمي آزاد مي شوند. سپس اين تخمك ها از طريق لوله رحمي مربوطه وارد رحم مي شوند. فوليكول هاي تخمداني متعددي در مراحل مختلف تكاملي در استروماي كورتكس واقع شده اند. بيشترين فوليكول ها، فوليكول هاي پریمورديال[7] هستند. هر فوليكول پريمورديال حاوي يك تخمک اوليه است كه توسط يك لايه از سلول هاي فوليكولي سنگفرشي احاطه شده است. در ادامه رشد اين فوليكول ها، سلول هاي فوليكولي تبديل به سلول هاي مكعبي يا استوانه اي كوتاه مي شوند ]148،81 [.
مجموع وقايعي كه منجر به توليد سلول زايايي تخمک در جنس ماده مي شود، باعث بروز تمامي واكنش هاي لازم قبل، حين و بعد از واكنش با اسپرم در تخمک می شود که شامل يك پروسة طولاني از تمايز اووگوني در تخمدان جنيني تا بلوغ نهايي تخمک، درست قبل از اوولاسيون آن مي باشد.
از مدت ها قبل مشخص شده كه فقط تعداد كمي از تخمک هاي اوليه حيوانات و نيز انسان مي توانند رشد ثانويه خود را دنبال کرده، تبديل به تخمک ثانويه شده و تخمك گذاري كنند. بطور مثال در مورد گاو تخمين زده اند که در تخمدان هاي گوساله تازه متولد شده حدود 200.000 تخمک وجود دارد که احتمالاً كمتر از 300 عدد آن ها به مرحله تخمك گذاري مي رسند] 52،136،20[.
در فرآیند بلوغ، اووسیت اولیه، پروفاز نخستین تقسیم میوزی پس از تولد را تکمیل می کند. در زمان بلوغ، تغییرات بعدی رخ می دهند. اووسیت اولیه حاوی تعدادی کرموزوم های دیپلوئید (xx) است. به طوری که در مرحله ی بلوغ، اووسیت بزرگ شده، سلول های فولیکولی، مکعبی و به چندین لایه تکثیر می یابند. همچنین یک غشای مخطط به نام زوناپلوسیدا[8]، پیرامون اووسیت تشکیل می شود (این لایه با به هم پیوستن زوايد اووسیت اولیه و گلیکوپروتئین موجود در محل تشکیل شده است)، فولیکول بزرگ شده و فضاهای پر از مایع، بین سلول های فولیکولی، پدیدار شده و به هم می پیوندند تا آنتروم فولیکول[9] را تشکیل دهند. به همین دلیل، سلول های فولیکولی، تفکیک می شوند تا لایه ی گرانولوزوم[10] و کومولوس اووفوروس[11]، را تشکیل دهند. تک خارجی[12] (لایه ی فیبروزی) و تک داخلی[13](لایه ی عروقی و سلولی) به وسیله ی سلول های استرومایی تخمدان در خارج از لایه ی گرانولوزوم، به وجود آمده و به این ترتیب، فولیکول گراف بالغ به وجود می آید. اووسیت اولیه، نخستین تقسیم میوزی را که در خلال حیات پیش از تولد آغاز شده بود، کامل می کند. در نتیجه دو سلول دختر هر یک با تعداد کروموزوم های هاپلوئید (n) تشکیل می شوند. در این فرآیند تقسیم هسته ای برابر بوده اما تقسیم سیتوپلاسمی نابرابر است. بنابراین یک سلول دختر که سیتوپلاسم فراوانی از سلول مادر دریافت کرده، بزرگ می شود. این سلول اووسیت ثانویه نامیده می شود. سلول کوچک، نخستین گویچه ی قطبی[14] است که در فضای پیرامون زرده ای[15]جای داده می شود. در شکل 1-1 روند کلی انجام اووژنز آمده است.
تخمک گذاری[16]، هنگامی رخ می دهد که یک فولیکول گراف بالغ در سطح تخمدان، پاره شود. تخمک گذاری می تواند در هر نقطه از سطح، به جز ناف تخمدان صورت گیرد. در این فرآیند، اووسیت ثانویه ی احاطه شده به وسیله ی زوناپلوسیدا و سلول های کومولوس اوفوروس از تخمدان بیرون رانده می شوند.
1-4-1-1- ویژگی های اووسیت ثانویه
الف: از سایر سلول ها بزرگتر است. قطر آن نزدیک به 150 میکرومتر است.
ب: غشای سلولی آن، غشای زرده ای[17] نامیده می شود. این غشا به وسیله ی زوناپلوسیدا، پوشیده شده است.
ج: فضای بین غشای زرده ای و زوناپلوسیدا فضای پیرامون زرده ای نامیده می شود.
د: هسته بزرگ خارج مرکزی و حاوی نیمی از کروموزوم ها است.
ه: در بیشتر پستانداران، اووپلاسم[18] یا زرده شبیه به سیتوپلاسم سلول ها ی دیگر است. این نوع تخم ها، تخم های
میکرولسیتال[19] (کم زرده) نامیده می شود. تخم های پرندگان، حاوی زرده سرشار از مواد مغذی (دیوتوپلاسم) بوده و به همین سبب تخم های ماکرولسیتال[20](پرزرده) نامیده می شوند.
اووسیت های پستانداران عالی، حاوی زرده ی اندکی هستند که تقریباً یکنواخت و پراکنده بوده و بنابراین تخم های ایزو لسیتال[21] نامیده می شوند.
و: سلول های پیرامون اووسیت، به طور شعاعی به زوناپلوسیدا، متصل شده اند. این لایه های سلولی تاج مشعشع[22] نامیده می شوند.
ز: سانتروزوم[23]با دو سانتریول[24]، مجاور هسته قرار گرفته است ] 22[.
1-4-2- روند ایجاد سلول جنسی نر[25]
فرآیند تبدیل سلول های جنسی اولیه ی نر به اسپرم، نتیجه ی مجموعه ای از تغییرات شیمیایی و فیزیکی است. این فرآیند از زمان بلوغ آغاز می شود. سلول های جنسی اولیه ی نر، از راه میتوز تقسیم شده و اسپرماتوگونیا را به وجود می آورند، آن ها تمایز می یابند تا اسپرماتوسیت های اولیه را به وجود آورند که هر یک از آن ها حاوی همان تعداد کروموزوم های دیپلوئید (2n) معمول گونه است. هر اسپرماتوسیت اولیه، دستخوش تقسیم کاهشی (میوز I) شده و دو سلول اسپرماتوسیت های ثانویه را به وجود می آورند. بنابراین، اسپرماتوسیت های ثانویه، حاوی تعداد کروموزوم های هاپلوئید (n) هستند. هر اسپرماتوسیت ثانویه، دیگر بار با تقسیم غیرکاهشی (میوزII)، تقسيم شده و اسپرماتید ها را به وجود می آورد.
اسپرماتید ها از راه فرآیند اسپرمیوژنز[26]، بدون هیچ تقسیم سلولی، متحمل تغییر شکل متامورفولوژیکی[27]شده و به اسپرماتوزوآ تبدیل می شوند. وزیکول های گلژی[28]به هم می پیوندند تا کلاهک سری تشکیل شود. سانتریول خلفی، فیلامنت های محور[29] بدنه و دم را به وجود می آورد. میتوکندری ها به شکل مارپیچی، آرایشی دوباره یافته و غلاف میتوکندریایی[30] را تشکیل می دهند و اسپرماتید طویل می شود]141[در شکل 1-1 روند کلی اسپرماتوژنز آمده است.
شکل 1-1- روند انجام اووژنزیزیس و اسپرماتوژنزیس]141[
1-4-3- لقاح
فرآیندی است که در خلال آن دو سلول جنسی بالغ (یک اسپرم و یک تخمک) در هم آمیخته و یک سلول واحد به نام سلول تخم را تشکیل می دهند. بنابراین سلول تخم، یک سلول دیپلوئید تمایز نیافته است که از در هم آمیختن دو گامت هاپلوئید بسیار تخصص یافته تشکیل شده است . لقاح در لوله ی رحمی رخ می دهد. در زمان لقاح، اووسیت ثانویه (هاپلوئید)، در پی تولید شدن از اووسیت اولیه با فرآیند نخستین تقسیم کاهش میوزی، آزاد می شود. اووسیت ثانویه، به لوله ی رحمی رسیده و در تماس با اسپرماتوزوآ قرار می گیرد.
در هر انزال[31] ، نزدیک به 200 تا 300 میلیون اسپرم، آزاد می شود. از این تعداد، نزدیک به 500 اسپرم به محل لقاح می رسند. تنها یک اسپرم پس از گذشتن از سد تاج مشعشع، زوناپلوسیدا و غشای زرده ای اووسیت ثانویه، به اووسیت می پیوندند. سایر اسپرم هایی که به تخمک رسیده اند، درگیر تجزیه ی ماتريكس بين سلول های تاج مشعشع به وسیله ی ترشح آنزیم هیالوروینداز[32]می شوند. بقیه ی اسپرم ها در عرض 24 ساعت پس از انزال می میرند. پس از لقاح وقايع زير رخ مي دهد:
1-اووسیت ثانویه، به محض ورود اسپرم، دومین تقسیم میوزی (بلوغ) را کامل کرده و همچنان که دومین گویچه ی قطبی[33] را به بیرون از غشای زرده ای (فضای پیرامون زرده ای) می راند، یک تخمک بالغ را تشکیل می دهد.
2- هسته ی تخمک بالغ، پیش هسته ی ماده[34] نامیده می شود. هم زمان، سر اسپرم، متورم می شود تا پیش هسته ی نر[35] را تشکیل دهد . هر دو پیش هسته، در هم آمیخته و تعداد کروموزوم دیپلوئید، دوباره در سلول تخم، بر قرار می شود.
3- جنسیت کروموزومی[36]، تعیین می شود. اگر اسپرم حاوی کروموزوم x ، تخمک را بارور کند، نتاج ماده شده و اگر یک اسپرم حاوی کروموزوم Y، تخمک را بارور کند یک حیوان نر، به وجود می آيد.
شکل 1-2- روند انجام لقاح از زمان رشد تخمک]141[
1-4-4- تسهیم
پس از تشکیل تخم، رویان متحمل تقسیمات میتوزی متعددی می شود. سلول تخم در مقایسه با سلول های غیر جنسی بدن دارای نسبت سیتوپلاسم به هسته بیشتری است. طی تقسیماتی که این سلول انجام می دهد، این نسبت به تدریج کوچکتر می شود ، یعنی از مقدار سیتوپلاسم آن به تدریج کم شده و هسته آن نسبتاً بزرگ تر می شود. این نوع تقسیمات را تسهیم گویند.
از طرفی الگو و نحوه تسهیم به میزان زرده ای که در زایگوت موجود است بستگی خواهد داشت . در پرندگان حجم زیاد زرده مانع از تقسیم کامل زایگوت شده ، بنابراین کلیواژ نسبی[37]و مروبلاستیک[38] است. کلیواژ کامل[39]یا هلو بلاستیک[40] در پستانداران جفت دار که زایگوت دارای حداقل مقدار زرده است رخ می دهد. تقسیمات میتوزی رویان را می توان به مراحل مختلف تقسیم کرد .
پس از اولین تقسیم، سلول تخم به رویان دو سلولی تبدیل می شود و هر یک از این سلول ها که اینک یک بلاستومر[41] نامیده می شود ، مجدداًً چندین بار تقسیم شده به ترتیب رویان های چهار سلولی ، هشت سلولی و شانزده سلولی را به وجود می آورند. در هر یک از این مراحل بلاستومر ها به طور هم زمان دچار تقسیمات میتوزی می شوند. حدوداً از مرحله ی شانزده سلولی به بعد در گاو، هم زمانی تقسیم میتوز بین بلاستومر ها از بین می رود و سلول ها از نظر فیزیولوژیکی تفرق می یابند. به عبارت دیگر تا مرحله شانزده سلولی هر یک از سلول ها قادرند که پس از چند تقسیم میتوزی به یک رویان تبدیل شوند ولی از مرحله شانزده سلولی به بعد سلول ها به گروه های مختلف (از نظر فیزولوژیکی) تقسیم شده و تقسیم وظایف می شوند.
زمانی که رویان به مرحله شانزده سلولی رسید مورولا[42] نامیده می شود . در مرحله ی مورولا بلاستومر ها از حالت کروی خارج می شوند و جداره ی سلول ها در تماس کامل با یکدیگر قرار می گیرند و نهایتاً یک توده ی سلولی کروی شکل ر ا به وجود می آورند. در این مرحله آن را مورولای متراکم[43]می گویند. تماس سلول ها به خصوص سلول هایی که در حاشیه ی توده ی سلولی مورولای متراکم قرار دارند، سبب می شود مایعاتی که وارد سلول ها شده، نتواند به راحتی از آن خارج شود.
هم زمان با انباشته شدن مایع در داخل توده ی سلولی، سلول ها به دو گروه تقسیم می شوند . بخشی از آن ها در حاشیه قرار می گیرند و تشکیل کیسه ای به نام تروفکتودرم[44]را مي دهند. سلول هاي تشكيل دهنده اين لايه را تروفوبلاست[45] يا سلول هاي حاشيه اي مي گويند. بقيه سلول هاي رويان كه در داخل كيسه ي تروفكتودرم قرار دارند به تدریج دور یکدیگر تجمع می یابند و تشکیل توده ی سلولی داخلی[46] را می دهند. سلول های تشکیل دهنده توده سلولی را سلول های رویانی یا امبریوبلاست[47]می نامند. سلول های رویانی مسئول ساختن بافت های مختلف بدن نوزاد هستند و سلول های حاشیه ای نیز پس از تحمل تغییراتی، به خارجی ترن لایه پرده های رویانی، یعنی لایه ی کوریون[48] تبدیل می شوند.
ترشحات بلاستومر ها در داخل مورولای متراکم جمع شده و حفره ی پر از مایعی را تشکیل می دهند. این مایعات در فضایی که در حد فاصل بین توده سلولی و لایه تروفکتودرم ایجاد می شود، تجمع می یابند. در نتیجه تجمع این مایعات، توده سلولی فشرده شده و به گوشه ای رانده می شود. فضایی را که این مایعات اشغال می کنند، بلاستوسل[49] و رویان بلاستوسل دار را بلاستوسیست[50] یا بلاستولا می نامند. به تناسب رشد بلاستوسیست، بلاستوسل به تدریج بزرگتر شده و توده سلولی کوچک تر می شود . بر همین اساس مرحله بلاستوسیست را می توان به بلاستوسیست اولیه[51]، بلاستوسیست و بلاستوسیست پیشرفته[52] تقسیم کرد.
در مرحله بلاستوسیست پیشرفته، بخش اعظم رویان به وسیله بلاستوسل اشغال می شود و توده ی سلولی تنها گوشه ای از حجم رویان را پر می کند. از این مرحله به بعد، افزایش حجم مایع بلاستوسل و رشد توده سلولی به گونه ای است که لایه ی شفاف نمی تواند آن را تحمل نماید. لذا لایه شفاف به تدریج نازک تر شده و نهایتاً پاره می شود.
پس از پاره شدن آن، رویان که اینک شامل توده سلولی، لایه حاشیه ای و حفرة بلاستوسل است، از لایه شفاف خارج شده، پس از آن می تواند به راحتی افزایش حجم یابد. رویان را در این مرحله بلاستوسیست آزاد[53]می گویند ] 73، 13[.
1-5- تولید جنین در شرایط In vitro
تولید جنین در شرایط آزمایشگاه شرایط تولید مقادیر انبوه جنین در مراحل تکاملی گوناگون را ایجاد می­کند و از این­رو بسیار مورد استقبال دانشمندان علوم­زیستی تولید مثلی و بیوتکنولوژی قرار گرفته است.
برخی کاربردهای این تکنیک عبارتند از:درمان ناباروری به­ویژه در انسان، ایجاد روش­های نوین تعیین جنسیت جنین، درمان بیماری­ها با استفاده از سلول­های بنیادی، مقاصد دارویی، تحقیقات در تمامی جنبه­های شبیه­سازی، پیشرفت فناوری تزریق ژن، مطالعه­ی مراحل مختلف جنینی و کاربردهای تجاری همانند تسهیل دوقلوزایی در گله­های گوشتی، سرعت بخشیدن به برنامه­های اصلاح نژاد، نجات گونه­های در حال انقراض و بسیاری کاربردهای دیگر[72،128].
پیشرفت موفقیت­آمیز و کاربرد گسترده این روش­ها و فناوری­های وابسته، ارتباط تنگاتنگی با گسترش فناوری­های پایه مرتبط با بلوغ آزمایشگاهی اووسیت[54]، لقاح آزمایشگاهی[55]، کشت آزمایشگاهی جنین[56]، تکنیک­های انتقال جنین[57] و روش­های کشت اسپرم در آزمایشگاه دارد.
در ابتدا در بسیاری از موارد، کار بر روی تخمدان­های جمع­آوری شده از کشتارگاه­ها انجام می­گرفت. امروزه نیز استفاده از نمونه ­های حاصل از کشتارگاه کاربرد فراوانی دارد، البته هم­اکنون یکی از روش­های متداول، برداشت اووسیت با استفاده از روش­های اولتراسونوگرافی از حیوانات بارور یا نابارور می­باشد.
1-5-1- بلوغ آزمایشگاهی تخمک (IVM)
بلوغ آزمایشگاهی تخمک روند بسیار پیچیده­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ است که هنوز تمامی جنبه­های آن هنوز به درستی شناخته نشده است. در بلوغ آزمایشگاهی تخمکمی­بایست محیط میکروآندوکرینی مناسب جهت بلوغ اووسیت فراهم گردد. در چنین شرایطی اووسیت های نابالغ میتوانند مراحل بلوغ سیتوپلاسمی و هسته­ای را با موفقیت پشت سر گذارند.
پیشینه پژوهش­ها در زمینه­ی بلوغ آزمایشگاهی اووسیت به هفتاد سال پیش می گردد. زمانی که پینکوس و همکارانش دریافتند که تعدادی از اووسیت­های نابالغ خرگوش پس از رها شدن از فولیکول آنترال و کشت در محیط مناسب میوز را از سر می­گیرند[121].
در اکثر پستانداران تخمک­های فولیکول­های تخمدانی در طی دوران جنینی وارد مرحله­ی میوزی از تقسیمات هسته­ای شده و تا قبل از زمان فراخوانی (تخمک گذاری یا آترزی) در مرحله­ی پروفازI از تقسیم میوزی متوقف باقی خواهد ماند(تا قبل از مرحله­ی بلوغ جنسی). در شرایط خارج سازی تخمک از فولیکول و انتقال آن به مدیای کشت مهار اعمال شده از جانب سلول­های گرانولوزا برداشته شده و لذا تقسیم میوزی از سر گرفته خواهد شد[122،36].
با این وجود در شرایط بلوغ آزمایشگاهی علی رغم اینکه حدود 80-70 درصد از تخمک­های کشت داده شده به مرحله­ی متافاز II از تقسیمات هسته­ای می­رسند لیکن تولید بلاستوسیست پس از انجام لقاح خارج رحمی به طور متوسط 30 درصد خواهد بود که علت این امر را میتوان تا حدود زیادی مربوط به نقصان بلوغ سیتوپلاسم دانست.
تخمک­های مورد نیاز برای رویان آزمایشگاهی از فولیکول­های تخمدان­هایی که در کشتارگاه جمع­آوری می­شوند به دست می­آید­[179]. به منظور انتقال تخمدان به آزمایشگاه از ظرف­های عایق حرارتی استفاده می­گردد تا در معرض نوسانات حرارتی کمتری قرار گیرند­.
در آزمایشگاه بافت­های اضافی را از تخمدان جدا نموده و تخمدان­ها را به­وسیله محلول­های مناسب شستشو می­دهند، سپس با سرنگ و پمپ خلاء و سرسوزن مناسب و یا با روش­های دیگر محتویات فولیکول­هایی را که در سطح تخمدان هستند تخلیه نموده و در لوله آزمایش مناسب قرار می­دهند. از اوایل دهه 1990 گرفتن تخمک از حیوانات دهنده­ی زنده در شرایط طبیعی از راه پاره کردن فولیکول به کمک لاپراسکوپی و اولتراسونوگرافی در حال گسترش است[78].
امااین روش­ها گران قیمت و میزان تخمک استحصالی به­ازای هر تخمدان بسیار کم است[119]. در گذشته از تکنیک جداسازی فولیکول آنترال کامل[58] به منظور دست­یابی به تخمک استفاده می­شد اما روش­های برش تخمدان[59][166] و آسپیراسیون[60][169]در گوسفند معمول­تر می­باشد. یکی از رایج­ترین روش­های استحصال تخمک­ها از تخمدان­های به­دست­آمده از کشتارگاه، آسپیراسیون می­باشد[169]. یکی از مشکلات این رهیافت این است که تنها 30 تا60 درصد تخمک­ها از فولیکول­ها استحصال می­شود در حالی که با تکنیک جداسازی فولیکول درصد استحصال تخمک­ها از فولیکول­ها به صددرصد نیز می­رسد. برتری این تکنیک سرعت اجرای آن است، آسپیراسیون سه­بار سریع­تر از جداسازی است. فولیکول­هایی با قطر 8-2 میلی­متر با نیدل اندازه 22-18 متصل به پمپ خلاء با فشار 100-75 میلی­متر جیوه آسپیره می­شوند[46]. افزایش فشار خلاء موجب کاهش تخمک­هایی با کیفیت مطلوب و زیست­پذیر شده که احتمالا˝به دلیل کنده شدن سلول­های کومولوس از اووسیت است. هنگامی که فشار خلاء بالاست افزایش چشمگیری در تعداد تخمک­های برهنه[61] دیده می­شود. با افزایش فشار آسپیراسیون تعداد COCs[62] کاهش می­یابد[16]. گفته می­شود تکنیک برش تخمدان سه­بار کند­تر از آسپیراسیون است اما با این روش می­توان تعداد تخمک­های استحصالی را افزایش داد.
جداسازی تخمک­های واجد شرایط برای تولید جنین از اهمیت ویژ­ه­ای برخوردار است. بر اساس آزمایش­های انجام شده تنها آن دسته از تخمک­های نارس قدرت بالغ شدن دارند که دارای چندین ردیف سلول کومولوس به­صورت متراکم و یکنواخت در اطراف خود بشند و سیتوپلاسم تخمک­ها یا اووپلاسم آنها نیز ترکیب یکنواختی داشته باشد. تخمک­های بدون سلول کومولوس یا دارای سلول­های کومولوس پراکنده و یا تخمک­های حاوی اووپلاسم قطعه قطعه شده، فاقد توانایی لازم جهت بالغ شدن هستند.
تحقیقات نشان می­دهد که در گوسفند فولیکول­هایی که قطر آنها بین 6-2 میلی­متر می­باشد، حاوی تخمک­های واجد شرایط برای بالغ شدن در شرایط آزمایشگاهی هستند و تخمک­هایی که از فولیکول­هایی با قطر کمتر از 2 میلی­متر و یا با قطر بیش از 6 میلی­متر تهیه می­شوند به ترتیب دارای سلول­های کومولوس کم و یا زیاد ولی پراکنده بوده­اند قابلیت بارور­شدن را ندارند. در عین حال جمع­آوری تخمک در آزمایشگاه معمولا از تمامی فولیکول­هایی که در سطح تخمدان حضور دارند صورت می­گیرد و ملاک انتخاب آن­ها مشخصات ظاهری خود تخمک­ها است که در زیر میکروسکوپ قابل مشاهده می­باشند.
ملاک بالغ شدن تخمک­ در شرایط آزمایشگاهی تداوم یافتن تقسیمات میوزی هسته تخمک و ظاهر شدن اولین گویچه قطبی(بلوغ هسته) و تغییر در فعالیت و نحوه استقرار ارگانل­های سیتوپلاسمی (بلوغ سیتوپلاسم)است. بنابر این برای انجام IVM موفق، بایستی بلوغ هسته­ای به همراه بلوغ سیتوپلاسمی در شرایط آزمایشگاه صورت پذیرد، به­طوری که حوادثی که در طی بلوغ تخمک رخ می­دهد، پیشرفت­های جنینی را تحت تاثیر قرار می­دهد[155]محیط کشت دارای بیشترین اثر در بلوغ تخمک است، یکی از بهترین محیط­ها و به­طور معمول محیطی که به منظور بلوغ تخمک­های گوسفند و بز به­کار رفته است TCM199[63] می­باشد. اسیدیته این محیط را بس از آماده نمودن آن، به­وسیله­ی یون­های بیکربنات یا محلول HEPES متعادل نموده و محیط را پس از غنی­سازی با سرم و هورمون­های مختلف مورد استفاده قرار می­دهند. افزودن گنادوتروپین­ها[64] (LH[65]،[66]FSH)و استرادیول به محیط بلوغ به­طور معناداری موجب افزایش میزان بلوغ گردیده [48،30،75]که به­طور اولیه باعث تنظیم نمودن بلوغ هسته­ی تخمک پستانداران می­شود و اثرات سودمند­شان برای تخمک­هایی که از حیوانات جوان نابالغ استحصال می­شود مشخص­تر است[80]. استرادیول نیز با تحریک DNA polymerase B و افزایش سنتز فاکتور مورد نیاز برای رشد پرونوکلئوس نر باعث انجام بلوغ سیتوپلاسمی می­شود.همچنین در حضور استرادیول میزان تولید بلاستوسیست افزایش می­یابد[118].
عموما به محیط بلوغ میزان 10-20 درصد سرم که در 56 درجه سانتی­گراد به مدت 30 دقیقه حرارت داده می­شود[67]، نیز اضافه می­شود. حرارت باعث غیر فعال شدن فاکتور­های نامساعدی چون کمپلمان می­شود.سرم به­عنوان یک منبع غذایی برای COCs مطرح می­شود،همچنین از سخت شدن زونا[68] زمانی که تخمک از محیط اطراف فولیکول آزاد می­شود، جلوگیری می­کند[168]در گوسفند و بز در بیشتر مطالعات سرم مورد استفاده FBS می­باشد[12،7،3].
غنی نمودن مدیای IVM با مایع فولیکولی از فولیکول­های غیرآترتیک و یا فولیکول­های بزرگ­تر از 4 میلی­متر که تحت تاثیر گنادوتروپین­ها قرار گرفته­اند، اثرات سودمندی خواهد داشت. به­طوری که اضافه نمودن مایع فولیکولی انسان یا گوسفند باعث افزایش راندمان لقاح تخمک­های گوسفند شده که این احتملا به دلیل حضور فاکتور­های رشد می­باشد[26]. سپس تخمک­ها به منظور طی نمودن روند بلوغ در محیط مطلوب در شرایط 38-39 درجه سانتی­گراد در 5 درصد CO2،رطوبت حداکثر به مدت 32-26 ساعت انکوبه می­شوند. به نظر می­رسد زمان انکوباسیون برای بلوغ تخمک­های بز نسبت به گوسفند طولانی­تر باشد، به­طوری که در یک­سری مطالعات عنوان شده که با کشت تخمک­های بز در مدیای TCM-199 به همراه 20 درصد FBS به مدت 32 ساعت نتایج بهتری حاصل می­شود[145،144].
1-5-2- ظرفیت پذیری اسپرم
مادامی که اسپرم ها، مسیر داخل لوله تناسلی ماده را طی نکرده اند، ظرفیت کامل برای لقاح تخمک را ندارند. اسپرم باید تغییرات فیزیولوژیکی تکمیلی (ظرفیت دارشدن اسپرم) را الزاماً متحمل شود تا بتواند از لایه ی شفاف عبور کرده و با زرده تخمک ادغام شود.
بسیاری از آزمایش های ابتدایی مربوط به لقاح آزمایشگاهی، ناموفق بودند، زیرا که اسپرم درآن ها ظرفیت دار نشده بود. ظرفیت دار شدن به معنی متحول شدن اسپرم در لوله تناسلی ماده است تا بتواند با تخمک لقاح یابد. در خلال ظرفیت پذیری، غشای پلاسمایی اسپرم متحمل واکنش های بیوشیمیایی شده و ناپایدار می گردد. در نتیجه این واکنش ها میزان نفوذپذیری غشاء به مواد مختلف به ویژه کلسیم تغییر می کند. اين تغييرات ظاهراً به عنوان عامل اصلی برای واکنش کلاهکی عمل می نمایند.
واکنش های کلاهکی موجب متراکم شدن ، شکسته شدن و نهایتاً متخلخل شدن غشا های پلاسمایی و خارجی کلاهک می شوند. کلاهک حاوی آنزیم هایی است که پس از متخلخل شدن از آن خارج گشته و بافت هایی را که در اطراف تخمک در مسیر حرکت اسپرم قرار دارند هضم نموده و از بین می برند و در نتیجه اسپرم قادر خواهد بود وارد تخمک شود و آن را بارور نماید. مطالعات نشان مي دهد كه شستشوي اسپرم قبل از انكوبه نمودن و قرار گرفتن در محيط هاي سرشار از يون و محيط هاي كلسيم دار مي توانند واكنش آكروزومي را در محيط آزمايشگاهي هدايت كرده و عمل لقاح را سرعت بخشند[177].
زماني كه اسپرم در محيط هاي يوني قرار مي گيرد، حركت، متابوليسم و ميزان برداشت اكسيژن و به طوركلي توانايي اسپرم براي نفوذ به تخمك تغيير مي يابد، در طي اين روند ميزان H+ داخل سلولي اسپرم افزايش يافته كه اين منجر به كاهش PH داخل سلولي و در نهايت يونيزاسيون پروتئين هاي داخلي غشاي اسپرم و پروتئين هاي موجود در مايع مني مي شود [119]. پروتئين به عنوان يك تركيب ضروري براي انجام ظرفیت پذیری موفق در شرايط آزمايشگاهي شناخته مي شود. به همين منظور ميزان 20 درصد Sheep Serum و يا BSA (4 mg/ml) به مدياي اسپرم اضافه مي شود [169].
پس از كشف گليكوزآمين گليكان (هپارين) به عنوان عامل ظرفيت دار كننده اسپرم گاو، فناوري لقاح آزمايشگاهي در حيوانات مزرعه اي پيشرفت چشمگيري كرد [119]. هپارين نيز با اسپرم باند شده باعث افزايش برداشت كلسيم توسط اسپرم مي شود، بنابراين با بهبود بخشيدن روند ظرفيت پذيري، باعث نتايج بهتري در IVF گاو و گوسفند مي شود [119].
با استفاده از تكنيك هاي [7]Swim up، گراديان پركل و سانتريفيوز نمودن [12،7]و فيلتراسيون مايع مني به وسيله ي ستون پشم شيشه ، مي توان اسپرم هاي متحرك را از اسپرم هاي غيرمتحرك به منظور انجام IVFجدا نمود. در موارد اسپرم تازه، با استفاده از روش هاي Swim up مي توان اسپرم متحرك بيشتري را جدا نمود اما در ميزان نفوذ اسپرم در تخمك و ميزان تسهيم هيچ تفاوتي بين دو روش Swim up و پركل ديده نمي شود. اما در مورد اسپرم منجمد استفاده از گراديان پركل و سانتريفيوز نمودن نتايج بهتري را در ميزان لقاح و پيشرفت هاي جنيني نسبت به روش هاي Swim up و ستون پشم شيشه ايجاد مي كند .
1-5-3- لقاح در شرایط آزمایشگاهی(IVF)
لقاح روند پیچیده­ای است. لقاح موفق نیازمند فراهم نمودن و تکمیل روند بلوغ تخمک، ظرفیت پذیری اسپرم، غلظت مناسب اسپرم جهت نفوذ به تخمک، کیفیت مناسب تخمک برای حمایت پیشرفت­های جنینی و شرایط کشت مساعد قابل قبول برای فعالیت­های متابولیسمی گامت­های نر و ماده می­باشد. لقاح از زمانی شروع می­شود که اسپرم به رسپتور­های زونای اووسیت ثانویه متصل شود. این رسپتور­ها به صورت اختصاصی عمل نموده به­طوری که اسپرم گاو تنها قادر به بارور ساختن تخمک گاو می­باشد.
از جمله تغییرات بیوشیمیایی که در اثر نفوذ اسپرم در تخمک حاصل می­شود تغییر در الگوی یون کلسیم داخل سلولی است، در طی پدیده لقاح موجب القای اگزوسیتوز گرانول­های کورتیکال و بلاک نمودن پلی اسپرمی می­شود[154].
عمده­ترین مشکل در روند لقاح وقوع پلی­اسپرمی می­باشد. در شرایط In Vivo دستگاه تولید مثلی ماده باعث کاهش تعداد اسپرم رسیده به تخمک می­شود. Kim و همکارانش در سال 1996 عنوان نمودند که انکوبه نمودن تخمک در مدیای محتوای 10 تا 30 درصد مایع اویداکتی قبل از لقاح موجب افزایش مونو­اسپرمی بدون هیچ­گونه اختلال در نفوذ اسپرم می­شود.مایع اویداکتی حاوی فاکتور­های لازم برای ایجاد مونو­اسپرمی و جلوگیری از پلی­اسپرمی می­باشد. نگهداری اسپرم و تخمک در خلال برنامه­های بلوغ تخمک، ظرفیت پذیری اسپرم و لقاح یافتن تخمک­ها معمولا در شرایط گرم­خانه­ای مخصوص(39 درجه سانتی­گراد، 5 درصد گاز CO2 ، حداکثر رطوبت) انجام می­گیرد. در تخمک­های پیر درصد لقاح چند اسپرمی بالاست و اگر تخمک خیلی پیر باشد، رشد رویانی غیر طبیعی شده یا آن­که از اول، لقاحی صورت نمی­گیرد. به نظر می­رسد در محیط­هایی که دارای آلبومین حرارت داده شده سرم خون یا آلبومین سرم خون گاو[69] هستند، واکنش کلاهکی[70]، به­مراتب راحت­تر صورت می­گیرد.
همچنین، لازم است یک منبع انرژی، مانند گلوکز یا پیروات در محیط وجود داشته باشد تا از تحریک اسپرم و متابولیسم تخمک پشتیبانی کند. برای مشاهده لقاح، میتوان با مشاهده میکروسکوپی و یا با رنگ آمیزی و تثبیت نمودن تخمک­ها 24-18 ساعت پس از تلقیح به وقوع تسهیم پی­برد. نرخ بالای لقاح در IVF، به وجود تعداد مناسب اسپرم­های باروری که به شدت متحرک بوده و تخمک­های باروری که دارای اولین گویچه قطبی هستند، بستگی دارد. بعضی از معیار­هایی که به عنوان نشانه لقاح به­کار می­روند عبارتند از:
1- نفوذ اسپرم به داخل اووپلاسم
2- تورم سر اسپرم، تشکیل پیش هسته نر
3- تسهیم با ظاهر طبیعی، تشکیل بلاستوسیست
4- متلاشی شدن دانه­های قشری
5- مشاهده دم یک اسپرم در اووپلاسم
هیچ یک از موارد فوق به­تنهایی نمی­تواند بیانگر لقاح طبیعی باشد، چرا که برای نمونه، رویان­های حاصل از بکرزایی[71]هم، بعضی از معیار­های فوق را دارا هستند.
1-5-4- کشت جنین در شرایط آزمایشگاه(IVC)
تکامل جنین­های پستانداران پیش از لانه گزینی به صورت In vitro با مشکلات زیادی همراه است. سیستم­های کشت موجود، نتوانسته­اند شرایط محیطی و فیزیکی دستگاه تناسلی ماده را فراهم کنند. در داخل سیستم تناسلی ماده، جنین در حال تکامل در معرض حجم کمی از مایع قرار می­گیرد و برعکس در محیط کشت، جنین در معرض حجم بیشتری از مایع قرار دارد. با وجود این، فاکتور­های اتوکرینی که به وسیله جنین ترشح می­شود در حجم زیاد مایع رقیق شده و ممکن است بی­اثر شود[72].
اکنون ثابی شده که در موش سرعت تسهیم و تشکیل یلاستوسیست با کم کردن حجم محیط افزایش می­یابد. نتایج مشابهی نیز از جنین گوسفند به دست آمده است، در ضمن فاکتور­های پاراکرینی هم که به وسیله سیستم تناسلی ماده ترشح می­شوند در محیط کشت وجود ندارد. بنابر این در روش­های اولیه­ای که برای کشت جنین تدوین شده بود، محیط­های کشت مورد استفاده پاسخ­گوی احتیاجات رشد جنین نبوده و رشد جنین پس از رسیدن به مرحله­ی 16- 8 سلولی متوقف می­گردد.
لذا برای تداوم رشد جنین و رسیدن به مراحل پیشرفته­تر(مورولا و بلاستوسیست) آن­ها را به شرایط طبیعی انتقال می دادند و برای این منظور از لوله رحمی حیواناتی نظیر گاو، گوسفند یا خرگوش استفاده می­نمودند. پس از اینکه جنین­ها چند روزی را در این شرایط سپری نمودند، آن­ها را از لوله رحمی خارج و مورد استفاده قرار می­دادند.
مهم­ترین مشکل این روش از دست دادن تعدادی از جنین­ها در جریان انتقال آن­ها به لوله رحمی میزبان واسط و بازیابی مجدد آن­ها بود. همچنین استفاده از حیوان زنده برای تامین تداوم رشد جنین­ها نیز کاری مشکل بود و کاربرد عملی نداشت. در تحقیقات بعدی محققین این مشکل را با اضافه نمودن سلول­های حمایت کننده رشد جنین (کشت هم­زمان سلول­های اویداکتی، کومولوس، اپیتلیال رحم، Vero، BRL و ....)، عوامل رشد و یا ترشحات لوله تناسلی به محیط کشت برطرف ساخته و امکان رشد جنین تا مرحله بلاستوسیست را در شرایط آزمایشگاهی فراهم نمودند. دو فرضیه راجع به چگونگی عملکرد سلول­ها در کشت هم­زمان وجود دارد:
الف) رها شدن فاکتور­های امبریوتروفیک اختصاصی و غیر اختصاصی از سلول­ها در طی تقسیمات آن­ها در محیط کشت که این عوامل یا به عنوان فاکتور­های رشد ، زمانی که جنین گیرنده آن را داشته باشد عمل می­کنند و یا متابولیت­های کوچک با وزن مولکولی کم که از تاخیر رشد جنین جلوگیری می­کنند.
ب) سلول­های کشت هم­زمان عوامل مزاحم را از محیط کشت بر می­دارند. در بسیاری از گونه­های پستانداران از جمله انسان، ایست تکوینی در برخی مراحل تکاملی مشاهده می­شود. ایست تکوینی جنین زمانی روی می­دهد که ژنوم جنینی شروع به فعالیت کند و به نظر می­رسد که کشت هم­زمان قادر است بر آن غلبه کند.
Minami و همکارانش در تحقیق خود به این نتیجه رسیدند که سلول­های لوله رحمی، فاکتور­هایی با وزن مولکولی کم ترشح می­کنند که به رشد جنین کمک می­کند(1992،Minami). محققان همچنین به این نتیجه رسیدند که این فاکتور­ها، امبریوتروفیک بوده و به رشد جنین کمک می­کند.
Mermillod و همکارانش گزارش کردند که دو فاکتور امبریوتروفیک متفاوت در محیط کشت بدون سرم در کشت همزمان با تک لایه­ی سلولی رحمی گاو وجود دارد که به تکامل جنین گاو تا مرحله بلاستوسیست کمک کرده و بر توانایی ادامه حیات آن­ها می­افزاید، یکی از این دو فاکتور با وزن مولکولی کمتر از 10 کیلو دالتون برای رسیدن به جنین به مرحله­ی 8-5 سلولی ضروری است و مشابه سرم جنین گاو عمل می­کند. فاکتور دیگر با وزن مولکولی بیشتر به جنین امکان می­دهد که از مرحله­ی هشت سلولی گذر کرده و تبدیل به بلاستوسیست شود[109]. تعدادی از فاکتور­های رشد نظیر (IGF) Insulin Growth Factor از سلول­های لوله رحمی انسان و همچنین سلول­های اپی­تلیوم لوله رحمی گاو ترشح می­شود که به رشد جنین کمک می­کند [71].
سلول­های (BRL) Buffalo Rat Liverاثرات تحریکی در تکامل جنین­های گاو دارند که (ILGF) Insulin Like Growth Factorو دیگر مولکول­های فعال بیولوژیکی را سنتز و ترشح می­کنند. اگر ILGF به محیط کشت اضافه شود تکامل جنین گوسفند بهتر شده و بر قدرت ادامه حیات آن­ها می­افزاید [45].تروفکتودرم دارای گیرنده­های ILGF می­باشد و در آندمتریوم رحم در فاز ترشحی یا بعد از تخمک گذاری یافت شده و در لانه گزینی جنین نقش تنظیم کنندگی دارد. عمل دیگر سلول­های سوماتیک در سیستم کشت هم­زمان برداشت مواد سمی از محیط، همچنین کاهش سطح متابولیت­های اکسیژن و ثابت نگه­داشتن میزان PH و اکسیژن و دی­اکسید کربن در محیط است. دیده شده این عوامل در تکامل جنین­های گاو که حاصل از لقاح در محیط کشت بوده­اند، تا رسیدن به مرحله­ی بلاستوسیستاثر می­گذارد[17].
1-6- مقایسه ی جنین های طبیعی با جنین های آزمایشگاهی
جنین هایی که در شرایط آزمایشگاهی تولید می شوند دارای تفاوت هایی با جنین های طبیعی هستند که این تفاوت ها قابل بررسی بوده و مورد توجه بسیاری از محققین است تا بلکه بتوانند عامل یا عوامل مولد این تفاوت ها را شناسایی و از بین ببرند. این اختلافات زمانی نمود یافتند که انتقال جنین های آزمایشگاهی درجه یک به گاو های گیرنده نتوانست نتایجی مشابه جنین های طبیعی به بار آورد. نتایج حاصل از انتقال جنین های طبیعی و آزمایشگاهی و بررسی عواملی نظیر راندمان آبستنی، دوقلوزایی، مرگ زودرس جنین، سقط جنین، ناقص الخلقه بودن جنین و ... نشان داد که توان حیاتی جنین های آزمایشگاهی کمتر از جنین های طبیعی است. پس از این مشاهدات بود که مقایسه دقیق خصوصیات ساختمانی این جنین ها مورد توجه قرار گرفت.
مقایسه ساختمان جنین های طبیعی و آزمایشکاهی نشان می دهد که جنین های آزمایشگاهی دارای واکوئل های سیتوپلاسمی بیشتر، شبکه ارتباطی کوتاه تر در میان سلول های تروفوبلاست و سلول های توده جنینی، پرزچه های ناقص تر روی سلول های تروفوبلاست و فضاهای بین سلولی عریض تر در مقایسه با جنین های طبیعی هستند.
شبکه های ارتباطی بین سلولی نقش مهمی در تداوم حیات جنین به ویژه در خلال برنا مه های انجماد جنین دارند. فضاهای بین سلولی عریض نیز موجب کاهش ظرفیت مبادلاتی جنین می شود. بررسی وضعیت رشد جنین ها نیز نشان می دهد که تبدیل وضعیت جنین از مرحله مورولا به بلاستوسیست در جنین های آزمایشگاهی 24 ساعت زودتر انجام می گیرد که این امر می تواند به دلیل بالا بودن درجه حرارت انکوباتور های مخصوص کشت جنین باشد. مرحله ی مورولای متراکم در جنین های آزمایشگاهی چندان آشکار دیده نمی شود، این جنین ها به طور کلی تیره تر از جنین های طبیعی هستند، توده سلولی آن ها کوچک تر بوده و حاوی واکوئل های بیشتری هستند. میزان آب جنین های طبیعی و آزمایشگاهی تقریباً یکسان و حدود 75 درصد کل وزن بدن آن ها می باشد. در عین حال اگر این جنین ها به محلول های قندی نظیر محلول ساکاروز انتقال داده شوند، جنین های طبیعی تا غلظت 35/2 مولار محلول را تحمل می کنند و از این غلظت به بعد به دلیل از دست دادن آب سبک شده و در سطح شناور می شوند، در صورتی که جنین های آزمایشگاهی در غلظت 6/1 مولار در محلول ساکارز شناور می شوند. این بدان معنی است که جنین های طبیعی سنگین تر از جنین های آزمایشگاهی بوده و دارای چگالی شناوری بیشتری هستند. احتمالاً این امر به دلیل اختلافی است که در نسبت چربی به پروتئین این جنین ها وجود دارد.
ظاهراً جنین های آزمایشگاهی حاوی قطرات چربی بیشتری نسبت به جنین های طبیعی هستند و حضور همین چربی اضافه تر، جنین های آزمایشگاهی را به انجماد حساس تر می نماید. مجموعه تفاوت های ظاهری که تاکنون بین جنین های طبیعی و آزمایشگاهی شناسایی شده است نمایانگر آن است که شرایط آزمایشگاهی برای تولید جنین های آزمایشگاهی کاملاً مناسب نیست و تحقیقاتی که در دست اجرا هستند تلاش دارند که ضمن تأمین شرایط لازم، این تفاوت ها را به حداقل برسانند [72].
1-7- انجماد
در دهه های اخیر افزایش شیوع انواع سرطان ها به ویژه در افراد زیر چهل سال گزارش شده است.روش های درمانی این بیماری ها به ویژه شیمی درمانی و پرتو درمانی اثرات مخربی بر غدد جنسی می گذارند و با تخریب سلول های جنسی موجب ناباروری بیماران می شوند. آسیب های غیر قابل جبرانی به فولیکول های تخمدان وارد می‏کنند.فولیکول ها نیز نسبت به داروهای سمی از حساسیت بالایی برخوردارند و در طی درمان به سلول های گرانولوزا تکا و اووسیتها آسیب وارد شده و در نهایت فولیکولا تخریب می‏شوند.با تخریب فولیکولها تخمک گذاری متوقف شده و تخمدان زودتر از زمان موعد وارد مرحله یائسگی می‏شودازین رو اغلب بیماران پس از طی دوره ی درمان و بهبودی ناچار از تحمل عارضه ناباروری در باقی مانده ی عمر خود هستند.این مساله به ویژه در کودکان مبتلا به سرطان اهمیتی دو چندان می یابد.در سال های اخیر همگام با پیشرفت دانش پزشکی در درمان انواع سرطان ها گام های موثری در زمینه ی فن آوری های نوین تولید مثل برداشته شده است و متخصصان وپژوهشگران حوزه ی باروری با پیشنهاد روشهایی برای حفظ باروری مبتلایان به انواع سرطان بهبود کیفیت زندگی آنها پس از درمان کمک کرده اند[2]. داروهایی که در درمان سرطان استفاده می‏شوند سمی بوده و بنابراین به منظور پیشگیری از ناباروری مبتلایان به سرطان باید قبل از استفاده از داروهای سمی اقدام به حفظ و ذخیره سازی تخمدان سالم شود.
بسیاری از پژوهشگران به دنبال روش هایی برای حفظ باروری قبل از درمان سرطان هستند. حفظ باروری در مردان با انجماد اسپرم و بافت بیضه انجام می شود اما برای حفظ قدرت باروی در زنان روش های متعددی وجود دارد که شامل انجماد جنین و اووسیت و بافت تخمدان می باشد. انتخاب یکی از روش های فوق به عوامل متعددی از جمله نوع سرطان سن بیمار و ضعیت تاهل فرد بستگی دارد[151].
انجماد و حفاظت جنین، روشی شناخته شده است که در بسیاری از کلینیک های ناباروری جهان انجام
می گیرد. در بیماران مبتلا به سرطان با استفاده از IVFمی نوان جنین هایی را برای استفاده در آینده ذخیره کرد به شرط آنکه بیمار متاهل باشد و قبل از شروع درمان زمان کافی برای انجام IVF و ذخیره ی جنین داشته باشد. اما از آنجایی که در سیکل های IVF پس از تحریک تخمک گذاری به طور معمول سطح استرادیول به ده برابر میزان استرادیول طبیعی می رسد در بعضی سرطان ها نظیر سرطان سینه این روش پیشنهاد نمی شود.
به طور کلی انجام و حفاظت جنین یک روش معمول و قابل اجرا در اکثر مراکز IVF است که کارایی بالایی نیز دارد. اما این روش محدودیت هایی نیز دارد که شامل موارد زیر است:هنگامی که به تاخیر انداختن شروع درمان امکان پذیر نباشد و در نتیجه زمانی برای تحریک تخمدان جهت گرفتن تخمک وجود نداشته باشد همچنین در مورد بیمارانی که تحریک تخمدان برایشان مضر است و یا برای کودکان و افراد مجرد این روش امکان پذیر نیست.
از آنجا که روش انجماد جنین در کودکان و زنان مجرد امکان پذیر نیست انجماد اووسیت در این دسته بیماران در صورتیکه زمان کافی قبل از شروع درمان داشته باشند می تواند مفید باشد. بر خلاف انجماد جنین و اسپرم نتایج اولیه در مورد انجماد اووسیت نا امیدکننده بود، بطوریکه میزان حاملگی حاصل از اووسیت فریز شده از 20 درصد تجاوز نمی کند.
در روش های انجماد اووسیت می توان از اووسیت های بالغ یا نابالغ استفاده کرد که نتایج متفاوتی از انجماد آن ها حاصل می شود. میزان حاملگی حاصل از اووسیت های بالغ منجمد شده به مراتب بیشتر اووست های نا بالغ است اما اووسیت های بالغ ویژگی هایی دارند که مانع موفقیت کامل این روش می شود. اندازه بزرگ و حجم زیاد اووسیت آسیب پذیری آن را نسبت به تشکیل کریستال های یخ افزایش می دهد. همچنین از آنجایی که اووسیت های بالغ در متافاز II متوقف شده اند، دوک های تقسیم نازک و شکننده و مستعد دپلیمریزه شدن دردمای پایین هستندو این امر می تواند موجب پراکندگی کروموزومی و آنوپلوییدی شود. با این حال چند مورد حاملگی حاصله از اووسیت منجمد شده گزارش شده است[123].
میزان حاملگی حاصل از انجماد اووسیت نابالغ از اووسیت بالغ کمتر است که به مشکلات تکنیکی مربوط می باشد که در طی پروسه ی انجماد و ذوب و بلوغ آزمایشگاهی اووسیت رخ می دهد. بطور کلی انجماد اووسیت یک روش جایگزین برای حفظ باروری بیماران مجرد است و در سال های اخیر متخصصین توانسته اند به پیشرفت های چشم گیری در زمینه آن دست یابند[55].
انجماد شامل فریز کردن و ذخیره سازی سلول ها در نیتروژن مایع در دمای -196ºc است.در این دما تمامی فرایندهای متابولیکی متوقف می شوند. فرایندهای فیزیولوژیک و وقایع سلولی در تقسیم سلولی دخیلند نیز بطور برگشت پذیر در اثر انجماد متوقف می شوند. یکی از دلایلی که در دمای -196ºcهیچ واکنش شیمیایی رخ نمی دهد این است که در دمای -130ºcدیگر آبی در سلول وجود ندارد و آب در واکنش های سلولی و حفظ عملکرد سلول بسیار ضروری است. همچنین در دمای -196ºc به علت پایین بودن انرژی گرمایی واکنش شیمیایی رخ نمی دهد[130].
1-7-1- مراحل اصلی انجماد
  • تماس بامواد محافظت کننده در برابر انجماد که آسیب سلولی ناشی از تشکیل کریستال یخ را به حداقل برساند.
  • کاهش پیش رونده ی درجه حرارت تا -196ºc
  • ذخیره سازی
  • ذوب کردن بعد از مدت زمان های متفاوت
  • رقیق کردن و شستن مواد محافظت کننده به منظور بازگرداندن سلول به محیط فیزیولوژیک اولیه جهت رشد بعدی آن
  • فریز می تواند آسیب هایی را به سلول وارد کند مثل آسیب حاصل از سرمازدگی-تشکیل کریستال یخ و چروکیدگی و پارگی غشا.
1-7-2- راههای کاهش اثرات زیانبار مواد محافظت کننده
  • استفاده از مواد انجماد دهنده با سمیت کمتر و نفوذ بالا (نظیر اتیلن گلیکول)
  • استفاده از دو ماده انجماد دهنده یا بیشتر که اثرات سمی هر یک کاهش یابد
  • بکار بردن مخلوطی از مواد انجماد دهنده ی نفوذ پذیر و غیر نفوذ پذیر
  • اضافه کردن مواد انجماد دهنده مرحله به مرحله به صورتی که غلظت آن در هر مرحله افزایش یابد.
1-7-3- روش­های انجماد
سه روش متفاوت جهت انجماد سلول­های پستانداران وجود دارد: روش متداول انجماد آهسته، سریع و روش انجماد شیشه­ای. انجماد آهسته و انجماد شیشه ای که تفاوت اصلی این دو روش در سرعت خنک کردن و غلظت مواد انجماد دهنده است. روش های مذکور اهداف مشابهی دارند که شامل حفظ سلول ها از آسیب های ناشی از انجماد نظیر تشکیل یخ درون سلولی و دهیدراته شدن و اثرات سمی انجماد می‏باشد. اگر چه این روش­ها تفاوت­هایی با یکدیگر دارند، لیکن هر کدام می­توانند نتایج موفقیت آمیزی در انجماد سلول­های پستانداران داشته باشند. موفقیت در انجماد به انتخاب روش مطلوب­تر برای هر نوع سلول بستگی دارد. توسعه­ی روش­های انجماد تخمک و جنین یک فاکتور اصلی در اصلاح نژاد پستانداران مانند گوسفند، گاو، بز و .... در سراسر جهان است. در این مطالعه اجمالا به تشریح روش انجماد شیشه­ای اکتفا می­کنیم.
1-7-3-1- انجماد شیشه­ای
در سال 1937 لویت استفاده از روش انجماد شیشه­ای را در انجماد بافت­ها شرح داد[96]. روش انجماد شیشه­ای شامل استفاده از غلظت بالای ضد یخ (7-5 مول) و سرعت خیلی بالای سرد کردن (25000-2000 درجه سانتی­گراد بر دقیقه) است. رال آورده است که هر آبی در سرعت سرد کردن 107 درجه سانتی­گراد بر دقیقه می­تواند شیشه­ای شود. سلول­ها زمانی که در معرض غلظت بالای ضد یخ قرار می­گیرند آبگیری می­شوند. سلول­های معلق در ضد یخ زمانی که مستقیما در نیتروژن مایع غوطه­ور می­شوند یک محیط شبیه شیشه را تشکیل می­دهند. این تکنیک یخ داخل سلولی را کاملا حذف می­کند[127]. با این وجود سلول­ها ممکن است در اثر مجاورت با غلظت خیلی بالای ضد یخ آسیب ببینند.
استراتژی انجماد شیشه­ای حذف کلی تشکیل یخ و سپس تلاش برای کاهش سمیت و تغییرات اسمزی است. روند فیزیکی انجماد شیشه­ای را می­توان به صورت انجماد سازی شبیه شیشه محلول­ها در دمای پایین بدون تشکیل یخ تعریف کرد. این پدیده می­تواند با افزایش غلظت و یا با افزایش سرعت انجماد و ذوب به دست آید. فاکتور­های دیگر تسهیل کننده­یانجماد شیشه­ای کاهش حجم محلول­ها و افزایش فشار هیدروستاتیک می­باشند. هر چند مورد آخر اهمیت عملی خیلی کمی در جنین شناسی دارد. در سال 1996 مارتینو و همکاران نشان دادند که در استفاده از سرعت بالای انجماد، تخمک گاو بعد از انجماد شیشه­ای هنوز توانایی رشد و تکامل تا مرحله بلاستوسیست را دارد [99].
1-7-3-1-1- عوامل تکنیکی موثر در انجماد شیشه­ای
1-7-3-1-1-1- زمان تعادل و آبگیری
آبگیری سلول­ها در انجماد بسیار مهم است. آسیب­های احتمالی سلول اغلب در دمای بین 15 و 90- درجه سانتی­گراد رخ می­دهند. اگر سلول کاملا آبگیری نشود زمانی که دما به پایین­تر از صفر درجه سانتی­گراد برسد، یخ داخل سلولی تشکیل می­گردد ]138[.
زمان مطلوب تعادل و آبگیری وابسته به دما است. نفوذپذیری و سمیت هر دو در دماهای بالا افزایش می­یابد ]159،32[. به طور کلی در فرایند انجماد شیشه­ای تماس کوتاه مدت نمونه با محلول انجماد مطلوب­تر است و برخلاف انجماد آهسته هر نی انجماد به تنهایی سرد می­شود ]159[. همچنین زمان تعادل وابسته به خصوصیات نفوذ­پذیری سلول­های مورد مطالعه است. نفوذ­پذیری جنین به ضد یخ در طی مراحل تکامل، به­طور قابل ملاحظه­ای تغییر می­کند. نشان داده شده است که میزان حیات مراحل مختلف تکاملی نمونه با محلول یکسان، متفاوت است ]27[. برای اجتناب از سمیت محلول انجماد شیشه­ای بایستی زمان تعادل جنین با محلول کوتاه باشد. باید توجه داشت اگر این مدت زمان خیلی کوتاه باشد نفوذ­پذیری ضد یخ کافی نبوده و یخ داخل سلولی تشکیل می­شود حتی اگر یخ خارج سلولی وجود نداشته باشد. بنابر­این زمان مطلوب تعادل بایستی به­گونه­ای باشد که از یک­طرف مانع آسیب ناشی از اثرات سمی به علت طولانی شدن زمان تعادل و از طرف دیگر مانع تشکیل یخ داخل سلولی شود. هم­چنین زمان تعادل وابسته به نوع و غلظت محلولی است که مورد استفاده قرار گرفته است. هر چه نفوز­پذیری محلول بیشتر باشد زمان لازم برای تعادل کوتاه­تر خواهد]74[.
1-7-3-1-1-2-سرعت سرد کردن
سرعت انجماد یکی از معیارهای اصلی بقای سلول در زمان انجماد است. سرعت انجماد خیلی آهسته ممکن است سلول­ها را به­خاطر مواجهه طولانی مدت با یک محلول غلیظ از بین ببرد. به­علاوه سرمادهی خیلی آهسته می­تواند باعث مرگ سلولی با تشکیل کریستال یخ شود. مازور معتقد است که ارتباط بقای سلول و سرعت انجماد می­تواند به صورت منحنی زنگی شکل باشد ] 105،104،103،102[. اساسا بقای سلول در سرمادهی با سرعت کم، پایین است، در میزان کمی بالا­تر از حد متوسط افزایش می­یابد و نهایتا در سرمادهی با سرعت بالا کاهش می­یابد. نفوذ­پذیری ضد­یخ­ها نیز با تغییر دما، تغییر می­یابد ]105[.
زمانی که سلول­ها در محلولی تا دمای زیر صفر درجه سرد می­شوند کریستال­های یخ ابتدا در محلول خارج سلولی شکل گرفته و سیتوپلاسم سلول دچار فرا سرما[72] می­شود. چنانچه سیتوپلاسم سلول تا دمای پایین­تر سرد شود (زیر 10- یا 15- درجه­سانتی­گراد) کریستال­های یخ ممکن است به­طور ناگهانی در خود سیتوپلاسم تشکیل شوند. این رخداد اغلب و نه مطلقا برای سلول مرگ­آور است. اگر سلول­هایی که داخل آن­ها منجمد شده­اند را خیلی گرم کنیم سلول ممکن است که از آسیب رهایی یابد]104[. در مقابل در انجماد شیشه­ای سلول­ها، در غلضت بالای محلول ضد­یخ سرد می­شوند و تحت سرعت انجماد بالا قرار می­گیرند که باعث می­شود کریستال یخ داخل سلولی تشکیل نشود.
انجماد شیشه­ای آب اطراف سلول می­تواند به دو روش به­دست آید: 1- افزایش سرعت انجماد 2- افزایش غلظت ضد­یخ که در مجموع با استفاده از حجم پایین یک محلول حاوی ضد­یخ غلیظ، این سرعت انجماد خیلی بالا که از 15000 تا 30000 درجه­سانتی­گراد بر دقیقه است،به­دست می­آید(0C – 25 0C=2210C/0.5 sec= 26520 0C/min169-=ΔΤ).
از آن­جایی که دو فاکتور خیلی مهم برای انجام انجماد شیشه­ای موفق سرعت انجماد بالا و غلظت بالای ضد­یخ می­باشد، بنابراین ایجاد توازن بین به حداکثر رسانیدن سرعت انجماد و به حداقل رسانیدن غلظت ضد­یخ، از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است. سرعت ایده­ال برای انجماد شیشه­ای سرعتی است که به آب داخل سلولی فرصت خارج شدن به منظور انجماد و یا شیشه­ای شدن در خارج سلول را می­دهد. بنابراین استراتژی اولیه هر پروتکل انجماد شیشه­ای موفقی باید گذر سریع از دمای بحرانی که بین 15 تا 5- درجه­سانتی­گراد است و در آن احتمال ایجاد آسیب­های برودت بالا می­رود، باشد. این امر خصوصا زمانی که نمونه حساسیت بالایی دارد نظیر ساختار­های غنی از چربی (مانند جنین خوک)، تخمک­ها و جنین­های در مرحله قبل از تراکم اهمیت پیدا می­کند.
به­محض فرو­بردن سلول­ها در نیتروژن مایع، نیتروژن مایع گرم شده و این امر به­طور پهناوری جوش را القا می­کند. در این نقطه تبخیر رخ می­دهد و یک پوشش بخار اطراف نمونه شکل می­گیرد.در نتیجه بخار اطراف نمونه می­تواند عایق موثری ایجاد کند که انتقال دما را کم کرده و در نتیجه سرعت انجماد کاهش می­یابد. بنابراین برای به­دست آوردن سرعت انجماد بالاتر، بهتر است که انتقال حرارت از طریق مایع به جای بخار صورت گیرد چرا که انتقال حرارت رسانشی در مایع خیلی سریع­تر از بخار است.
سه راه عملی برای افزایش سرعت انجماد و ذوب عبارتنداز:
- کاهش حجم محیط اطراف تخمک و جنین
- به حداقل رسانیدن عایق سازی حرارتی[73]
- ترجیحاٌ تماس مستقیم بین محلول ضد­یخ و نیتروژن مایع و اجتناب از تشکیل بخار نیتروژن مایع.
همان­طور که گفته شد امکان دیگر بهبود سرعت انجماد و ذوب جلوگیری از تشکیل بخار نیتروژن مایع است. اخیراٌ دو راه­حل برای رفع این مسئله مطرح شده است. اولین راه­حل امکان فرا سرمادهی نیتروژن مایع است. ایجاد خلاء روی نیتروژن مایع برای مدت زمان کوتاه، دما می­تواند تا 205- یا 210- درجه­سانتی­گراد و بسیار دور از نقطه جوش کاهش یابد. این امر امکان تشکیل پوشش گازی اطراف نمونه را به حداقل رسانده و متعاقباٌ سرعت انجماد را افزایش می­دهد. راه حل دیگر، قرار دادن جنین و یا تخمک بر روی یک صفحه فلزی فراسرما داده شده تا 150 درجه­سانتی­گراد (انجماد شیشه­ای با استفاده از سطح جامد) است.
1-7-3-1-1-3- سرعت گرم کردن
سرعت ذوب نیز برای نگهداری سلول­های پستانداران در شرایط انجماد خیلی مهم است. سرعت متوسط ذوب برای یک نوع مشخص سلول کاملاٌ به سرعت متوسط انجماد که سابق بر آن داشته است وابسته است. در ابتدا تحقیقات نشان دادند که گرم کردن سریع سلول­های پستانداران بعد از انجماد همیشه بهتر است چرا که سلول­ها زمان کوتاه­تری برای دوباره کریستاله شدن داشته و کمتر در معرض ضد­یخ قرار می­گیرند. اما اولین تحقیق بر روی انجماد جنین موش توسط ویتینگهام و همکاران نشان داد که استثنائاتی در این قانون وجود دارد. مطالعه آن ها نشان داد که جنین هایی که به روش آهسته منجمد می شوند زمانی که به آهستگی ذوب می شوند بقای بعد از ذوب بیشتری خواهند داشت. در حقیقت آن ها گزارش دادند که بقای جنین به گرم کردن با سرعت پایین وابسته است. آن ها نتیجه گرفتند که میزان بقای ضعیف در اثر سریع گرم کردن احتمالاً به خاطر تأثیرات اسمزی رخ می دهد]177[.
عمومی ترین روش گرم کردن تخمک و جنین ها بعد از انجماد شیشه ای روش سریع و مستقیم است. معمولاً تخمک و جنین ها به محلول 37-20 درجه سانتی گراد منتقل می شوند. بعد از گرم کردن باید آب دهی شده و ضدیخ استفاده شده در امر انجماد شیشه ای حذف گردد. این امر باید سریع صورت گیرد اما در مورد رقیق کردن چند مرحله ای هنوز بحث وجود دارد.
1-7-3-1-1-4- مواد محافظ انجمادی
زمانی که سلول های پستانداران در یک محلول رقیق نمکی سرد و منجمد شوند، کاملاً آسیب دیده و از بین می روند. با توضیح بالا باید گفت که زنده ماندن اسپرماتوزوئیدهای طیور زمانی که در یک محلول حاوی 10 درصد گلیسرول به اضافه آلبومین منجمد شوند، در سال 1949 به صورت کاملاً تصادفی مشخص شد ]126[. بعد از آن گوساله حاصل از تلقیح مصنوعی اسپرم منجمد- ذوب شده به دنیا آمد ]152،125 [. این موارد اولین مطالعات روشنی بود که نشان دادند سلول های پستانداران می توانند با افزودن یک مکمل به محیط کشت با موفقیت منجمد شوند ]54[.
از اولین کشفیات تا کنون پی برده­اند که تعداد زیادی از ترکیبات با وزن مولکولی پایین، از سلول علیه آسیب انجماد محافظت می­کنند. این ترکیبات که امروزه تحت عنوان ضد­یخ[74] نامیده می­شوند، همگی با هر نسبتی قابل حل در آب هستند. این ترکیبات همچنین برای سلول نسبتاً غیر سمی بوده و وزن مولکولی پایینی دارند. این افزودنی­های محافظ به محلول­هایی که جهت انجماد سلول در نقطه پایین­تر از نقطه انجماد استفاده می­شوند اضافه می­گردند. ضد­یخ­ها همچنین با تاثیر بر لیپید موجود در غشای سلولی، این غشا را ارتجاعی می­سازند.
1-7-3-1-1-5- نقش ضدیخ ها
ضد یخ ها با حضور در محلول های انجمادی تأثیرات خود را به اشکال زیر اعمال می کنند:
1- پایین آوردن نقطه انجماد: افزودن ضدیخ به محلول انجماد باعث کاهش جزیی نقطه انجماد می شود.
2- کاهش اثر سمی سایر ترکیبات محلول: ضد یخ با اتصال به ملکول های آب باعث کاهش اثر سمی دیگر ترکیبات محلول می شود. این حالت را تحت عنوان ویژگی انعقادی[75]می شناسند.
3- عدم تشکیل کریستال یخ: در زمان استفاده از غلظت بالای ضد یخ (انجماد شیشه ای) کریستال یخ تشکیل نمی شود. محافظت از نمونه با افزایش سطح نمک: زمانی که نمونه آب زیادی از دست می دهد ضد یخ از طریق افزایش سطح نمک باعث محافظت از نمونه می شود؛ این ویژگی را با عنوان Salt buffering می شناسند.
1-7-3-1-1-6- ذوب و آبدهی
ذوب سریع نی برای بقای مطلوب جنین گاو بدون توجه به نوع ضد یخ ضروری به نظر می رسد ضد یخ ها به واسطه تأثیرات سمی خود در دماهای بالاتر حتماً باید در فرایند ذوب از جنین خارج شود. اگر جنین مستقیماً در یک محلول ایزوتونیک نظیر PBS قرار گیرد، هیپراسمولالیتی داخل سلولی باعث تورم زیاد بلاستومر و نهایتاً مرگ جنین می شود.
همان طور که توسط Hasler در سال 2002 تشریح شده است یک پروتکل عمومی ذوب شامل قرار دادن نی برای مدت 5 تا 10 ثانیه در هوا و به دنبال آن فرو بردن نی در آب 30-25 درجه سانتی گراد تا زمان ذوب کامل یخ می باشد. همان مولف آورده است که ذوب کامل نی در هوا باعث کاهش قابلیت جنین می شود. هرچند ذوب مستقیم و دفعتاً در آب، رخداد بیشتر شکستگی زونا پلوسیدا را در پی خواهد داشت.
در مورد جنین های منجمد شده با محیط حاوی گلیسرول حذف ضد یخ قبل از انتقال جنین به رحم حیوان گیرنده ضروری به نظر می رسد و برای جنین های منجمد شده با محیط حاوی اتیلن گلیکول، حذف ضد یخ از جنین می تواند در رحم حیوان گیرنده نیز صورت گیرد.
1-8- آلدوسترون
1-8-1- خصوصیات
مینرالوکورتیکوئیدها (mineralocorticoid)‏ به گروهی از استروئیدها [مانند آلدوسترون (۲۱ کربنه)] گفته می شود که در بخش قشری غده فوق کلیوی ساخته می شوند. استروئیدها ترکیبات چربی با چهار حلقه کربنی هستند. آلدوسترون مهمترین مینرالوکورتیکوئید بدن است. تفاوت اصلی مینرالوکورتیکوئیدها با سایر کورتیکواستروئیدها در گیرنده های اختصاصیشان و تاثیراتشان بر بدن است. میزان ترشح آلدوسترون در شبانه روز ۱۵۰ میکروگرم است.
1-8-2- عملکرد
آلدوسترون نقش محوری در هموستاز مایعات و الکترولیت ها ایفا می کند و در نتیجه باعث کنترل
فشار خون می­گردد. آلدوسترون، به عنوان یک مینرالوکورتیکوئید فعال، سیگنال نهایی غدد درون ریز در سیستم رنین آنژیوتانسین- آلدوسترون است که هدفش سلول های اپیتلیوم در کلیه و روده بزرگ، برای تنظیم بازجذب سدیم وترشح پتاسیم می­باشد. آلدوسترون همچنین فعالیتNa+/K+ ATPase را در تثبیت ظرفیت انتقال سدیم و پتاسیم، در سلول های اپیتلیوم در کلیه و روده بزرگ افزایش می دهد.(شکل 1-5)

شکل 1-5- دو مکانیسم عملکرد مولکولی آلدوسترون ]18[
آلدوسترون از طریق دو مکانیسم ملکولی بر روی نسخه بردای ژن ها تأثیر می گذارد: اول، روش کلاسیک و دوم، تعامل پروتیین- پروتیین. در روش کلاسیک کمپلکس استرویید- گیرنده به طور مستقیم به DNA ژنومی متصل شده و بدین ترتیب از طریق تحریک و یا مهار رونویسی موجب افزایش یا کاهش بیان ژن می گردد. در روش دوم، گیرنده های استروییدی بر روی یک سری واسطه های پروتیینی عمل نموده و آلدوسترون از این طریق با DNA باند می شود که در این روش، تنظیم بیان ژن بدون نیاز به گیرنده استروییدی بر روی DNA و از طریق این ترکیب پروتیین- پروتیین انجام می شود. برخی از مهمترین پروتیین هایی که آلدوسترون جهت اعمال اثرات خود با آنها باند می شود عبارتند از: دی اسیل گلیسرول (DAG)، اینوزیتول تری فسفات (IP3)، پروتیین کیناز C (PKC) و cAMP]18[
[1]- Asisted Reproductive Technology
[2] - Nuclear transfer
[3] - Mitotic promoting factor
1- Oogenesis
[5]- Ovulatian
[6]- Ovulation phase
[7]- Primordial follicle
2- Zona pellucida


دریافت فایل
جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید




تاثیر آلدوسترون


جنین تخمک های منجمد شده


دانلودپایان نامه


word


مقاله


پاورپوینت


فایل فلش


کارآموزی


گزارش تخصصی


اقدام پژوهی


درس پژوهی


جزوه


خلاصه