ارزیابی بیان ژنهای λ Red در سویه های E.coli, Vibrio Cholerae - دانلود رایگان
دانلود رایگان نوترکیبی همسان فرایندی است که در آن میتوان به تحریک ژنهای خاصی اقدام نمود که در نهایت با عملکرد جدید این ژنها میتوان یک ارگانیسم را به تولید یا عدم تولید ی
دانلود رایگان
| ارزیابی بیان ژنهای λ Red در سویه های E.coli, Vibrio Cholerae & Shigella dysentrieaeجهت بهینه شدن نو ترکیبی همسان چکیده نوترکیبی همسان فرایندی است که در آن میتوان به تحریک ژنهای خاصی اقدام نمود که در نهایت با عملکرد جدید این ژنها میتوان یک ارگانیسم را به تولید یا عدم تولید یک پروتئین خاص وادار نمود. در حال حاضر تحقیقات گوناگونی وجود دارد که در آنها از نوترکیببی همسان استفاده میشود. هرچقدر این روشها بهینهتر گردند، مسلما فرایندهای اقدامات آزمایشگاهی را تسهیل خواهد نمود، در نوترکیبی همسان قطعه ای از محصول PCR به داخل کروموزوم باکتری وارد شده و با استفاده از وکتورهای λ-Redقادرخواهیم بود که ژن recA را در میزبان تحریک کرده ونوترکیبی همسان را به انجام برسانیم. درمطالعات قبلی نشان داده شده است که طول توالیهای انتهایی(flank) دو سر انتهای محصولPCR نقش مهمی در انجام نوترکیبی همسان دارد، ولی انتخاب طول flank طبق قاعده و قانون خاصی نیست و محقق باید بصورت آزمون و خطا این طول را انتخاب نماید. در مطالعات انجام شده بر سویه های استاندارد، طول این flank میتواند از 50 تا 2000 جفت باز متغیر می باشد.در این مطالعه ابتدا باکتری های استاندارد dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Choleraeدر محیط غذایی کشت داده میشود و سپس کلنی مساوی از هر یک از باکتری ها را انتخاب و جهت استخراج totalRNA به کار میرود. پس از تهیه total RNA آن را تبدیل به total cDNA می کنیم،. جهت تعیین وارزیابی بیان ژن l-Redاز تکنیک Real-timePCR با استفاده از SYBR greenІ و روش Relative استفاده نموده و میزان بیان ژنهای l-Redرا در هر میزبان به دست خواهد داد.ژنهای l-Red ومیزان بیان آن در میزبان های متفاوت متغیر بوده و قطعا با ارزیابی بیان آن می توان تا حدود زیادی طول مناسب را جهت نوترکیبی همسان تعیین کرد. در آن پایان نامه تلاش میگردد تا فرایند انجام نوترکیبی همسان در سویه های باکتری dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Choleraeرا تسهیل نمود. به عبارتی قرار است بررسی گردد آیا نتایج بدست آمده باعث کمک به بهبود فرایند نوترکیبی همسان میشود یا خیر؟ و واضح است که هر چه میزان بیان ژنهای l-Redبیشتر باشد، بازده نوترکیبی همسان با طول کمتر flank نیز میسرتر است. واژگان کلیدی: نوترکیبی همولوگ، ژن l-Red، dysentrieaeShigella,E.coli, Vibrio Cholerae فهرست مطالب عنوان صفحه فصل اول:مقدمه 1-6E.coli14 E.coli15 E.coli16 Shigella. 16 Shigella. 16 Vibrio Cholerae. 17 ).. 22 فصل دوم: سابقه و پیشینه λ-Red. 29 46. 30 فصل سوم: مواد و روش ها Transformation. 33 فصل چهارم: نتایج فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری فهرست جداول عنوان صفحه Real-Time PCR.. 38 600 ویبریوکلرا در هر 30 دقیقه و تعداد کلنی در واحد حجم.. 40 OD600 Shigellaدر هر 30 دقیقه و تعداد کلنی در واحد حجم 42 OD60 0E.Coliدر هر 30 دقیقه و تعداد کلنی در واحد حجم فرمت.. 43 dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae. 46 فهرست اشكال عنوان صفحه exo, bet وgam بر روی DNA دو رشته ای.. 5 0E.Coli در طول 18 ساعت.. 43 dnaEو λ-Red.. 4 1-1 انتقال ژن در باکتری در اكثر باكتري ها توراث ژنها اغلب به صورت عمودي است اما قسمت قابل توجهي از آن توسط انتقال جانبي يا عرضي بين باكتري ها انتقال مي يابد. عناصر ژنتيكي متحرك مثل پلاسميدها، باكتريوفاژها و ترانسپوزون ها به همراه تغیيرات ژني مثل حذف، اضافه شدن و ترتيب دوباره ژن ها سير تكاملي پروكاريوتها را تسريع كرده اند و باعث ايجاد تغييرات در ژنوم باكتري ها و در نتيجه ايجاد تنوع ژنتيكي گردیده اند. باكتري ها با توجه به داشتن ژنوم كوچكتر نسبت به يوكاريوتها توانايي بيشتري براي به اشتراك گذاشتن ژنومشان از طريق انتقال عرضي ژن توسط هم یوغی، ترانسداكشن[1] و ترانسفورميشن[2] دارند. مهمترين فرآيند هم یوغی است كه طي تمـاس مستقيـم سلول با سلول اتفاق ميافتد (Proter 1997; Burrus 2006). هم یوغی امكان تغيرات ژنتيكي بين باكتريها و گاه حتي بين سلولهاي يوكاريوتي را امكان پذير مي سازد و اغلب توسط آن ژن هاي موجود بر روي پلاسميدهاي كانژوگه منتقل مي شوند. ترانسداكشن نوع ديگري از انتقال افقي ژن است كه توسط ويروس ها و باكتريوفاژها صورت مي پذيرد. بعضي از باكتريوفاژها مي توانند به صورت يك پروفاژ به داخل كروموزوم باكتري ميزبان وارد شده و باعث ليزوژني آن شوند. پروفاژها قسمت مهمي از اكتساب افقي ژن را در DNAبسياري از باكتريها به خود اختصاص داده اند. گاهي اوقات باكتريوفاژها باعث انتقال قسمت هاي متحرك ديگري از DNAباكتري و يا قسمتي ديگر از DNAثابت باكتري مي شوند و اين زماني اتفاق مي افتد كه خروج فاژ به صورت دقيق صورت نگيرد. اين مرحله ترانسداكشن تخصصي [3] ناميده مي شود. سومين نحوه انتقال ترانسفورميشن است كه در آن DNAآزاد از محيط برداشته ميشود. براي پايدار ماندن DNAوارد شده به ژنوم ميزبان طي هر سه روش احتياج به يك سري مراحل حمايت كننده مثل نوترکیبی یکسان[4] مي باشد. همگان قبول دارند كه اكتساب توالي هاي جديد و توسعه ژنوم امري حياتي براي تكامل ميباشند. اين که آيا ژن هاي اكتسابي در باكتري نگه داشته مي شوند و يا اين كه چگونه باقي مي مانند بستگي به عملكرد آن ژنها و فشار انتخابي محيط براي نگه داشتن آن دارد .( Proter 1997) 1-2 ترانسفورماسیون ترانسفورماسیون یکی از راههای انتقال توارث به سایر باکتریها میباشد. در این روش یک تکه DNAدو رشته ای آزاد در محیط به سطح یک باکتری دیگر متصل شده و تنها یک رشته آن وارد باکتری شده و در کروموزوم باکتری میزبان ادغام می شود. برای داخل شدن قطعه ای از DNAدر درون کروموزوم، عملکرد اپرون UVrABCD (UVدر اول اسم اپرون مخفف پرتو UVاست )ژن rec Aبر اثر عوامل مثل uv ، عوامل شیمیایی و ورود DNA تک رشته ای به درون باکتری فعال میشودو rABCDمخفف ژنهایrecA, recB, recC و recDمیباشد) این اپرون شامل ژنهای recA, recB, recCوrecD میباشد. فرآیند نوترکیبی[5] بواسطه پروتئین RecAفعال میگردد. در این فرآیند، اگر DNAتک رشته ای وارد شده در باکتری، با ناحیه ای از کروموزوم تشابه داشته باشد، تعویض میگردد که این جابجایی بواسطه پروتئین RecAانجام می پذیرد. از طرفی ژنهایrecB, recC وrecDنقش تنظیمی، با عملکرد منفی بر روی ژن recAرا بازی میکنند(Hamood et al., 1986). در حال حاضر، در آزمایشگاههای تحقیقاتی، با استفاده از این سیستم و نحوه ادغام فاژ λ وکتوری (وکتور ها مولکول های DNA ای هستند که برای کلون کردن قطعات DNAدر سلول های میزبان به کار می روند) را تولید نموده اند که میزان نوترکیبی را در باکتریها افزایش میدهند. در این وکتور سه ژن exo, bet وgamرا تحت یک پروموتری که با L-arabinoseتحریک می شود قرار داده اند. عملکرد این سه ژن بدین صورت است که پروتئین Exoباعث هضم نوکلئوتیدها از قسمت 5’ انتهای DNAدو رشته ای میشود و پروتئین Bet با حفاظت از قسمت تک رشته ای 3’ بوجود آمده، مانع تخریب آن میگردد. نهایتا پروتئین Gam با ممانعت از عملکرد ژنهای recB,recC وrecDباعث تحریک بیان ژن recAدر باکتریها می شود (شکل1-1). مارکر مقاومت آنتی بیوتیکی در این وکتور آمپی سیلین بوده و از نظر تعداد پلاسمید در باکتریها، جزء پلاسمیدهای شمارش تکرار پایین[6]محسوب میگردد. بهترین دما، برای تکثیر این وکتور 30 درجه سانتیگراد بوده و در دمای 42-37 درجه سانتیگراد از دست میرود. بنابراین از این نظر، جزء پلاسمیدهای حساس به دما[7] نیز تقسیمبندی میگردد (Yamamoto et al., 2009). مهمترین و کاربردی ترین پلاسمید در این زمینه pKD46 بوده که قابلیت تکثیر، در dysentrieaeShigella,E.coli, Vibrio Choleraeرا دارد. شکل (1-1) عملکرد ژنهای exo, bet وgam بر روی DNA دو رشته ای 1-3 نوترکیبی نوترکیبی[8] ژنتیکی فرآیندی است؛ که طی آن مولکول اسیدنوکلئیک شکسته شده و به شکلهای مختلف به یکدیگر متصل می شوند. این عمل در بیشتر مواقع مربوط به DNA و گاهی درRNAنیز دیده می شود. نوترکیبی می تواند بین کروموزوم های همولوگ باشد که به آن نوترکیبی همسان گفته می شود. نوترکیبی به طور معمول روشی برای ترمیم DNAپروکاریوت و یوکاریوت ها می باشد که در یوکاریوت ها در میوز رخ داده و به آن فرآیند کراسینگ اور می گویند. در طی آن جابه جایی کروموزوم پدر و مادری رخ می دهد و می تواند سبب تولید الل جدید شود. در سیستم ایمنی این فرآیند نقش بسیار مهمی را ایفا میکند وسبب مقاومت بدن در مقابل بیماریزاهای مختلف می شود. شکل( 1-2) نوترکیبی نوترکیبی روشی مفید در مهندسی ژنتیک محسوب می شود. از نوترکیبی می توان جهت ایجاد تغییر در نوکلئوتیدهای ژنوم باکتری ها، ویروس ها،BACs[9]،[10]PACو پلاسمیدها استفاده کرد. ولی لازم به ذکر است که نوترکیبی در محیط زنده[11] نیز انجام می پذیرد. بنابراین برای ایجاد چنین تغییری در ژنوم می توان از نوترکیبی همسان[12] استفاده کرد. در نوترکیبی همسان باید از محصول PCR[13] که انتهاهای آن به صورت تک رشتهای در آمده و یا از تک رشته های DNAسنتتیک استفاده نمود. در پروکاریوت ها میزان ایجاد نوترکیبی طبیعی10-5-10-4 میباشد ولی میزان ایجاد نوترکیبی همسان 10-1/0 درصد می باشد. در نوترکیبی همسان مهمترین فاکتور طول قسمتهای انتهایی محصول PCRمیباشد که به خاطر عملکرد محصول ژن betصورت تک رشته ای در آمده است. هر چه میزان طول ترادف های همسان بیشتر باشد بازده ی نوترکیبی همسان بیشتر خواهد بود. پدیده ی نوترکیبی همسان به واسطه ی بیان ژنrecA در باکتری ها صورت می گیرد. بنابراین هر چه میزان بیان ژن recAبیشتر باشد بازدهی نوترکیبی همسان نیز بیشتر خواهد بود (Sharan et al.,2009). نوترکیبی همسان در باکتریها بواسطه ی حضور پر رنگ بیان ژنrecA صورت می گیرد. بیان ژنrecAبواسطه ی اپرون recBCD. (اپرون واحد عملکردDNAژنومی است که شامل مجموعه ای از ژن های تحت کنترل یک سیگنال نظارتی یا پروموتر است) کنترل و سرکوب میگردد تا از بیان افسار گسیخته ی آن جلوگیری شود. کاهش بیان ژن recA باعث کاهش میزان نوترکیبی می گردد. در نتیجه برای افزایش بازدهی آن به تحریک بیان ژن recA به عنوان کلید حل این معما استفاده کرد (Murphy et al., 2000). سیستم نوترکیبی مبتنی بر λ-Redدر تغییر ژن ها بسیار سودمند میباشد. شیوه های ساده ای برای غیر فعال سازی و تغییر ژنها و نوکلئوتیدها در باکتریها با استفاده از تکنیک بازسازی ژنتیکی سلول وجود دارد، این امر با کمک سیستم نوترکیبیλ-Red و محصول PCR حامل یک کاست مقاومت انتی بیوتیکی روی کروموزوم باکتری صورت می گیرد و هر چه طول انتهای همولوگ بیشتر باشد، بازدهی نوترکیبی همسان بیشتر خواهد بود (Yamamoto et al., 2009). نوترکیبی همولوگ در ترمیم DNAآسیب دیده در حین همانندسازی DNA موثر است. در سلولهای یوکاریوتیک میزان نوترکیبی همسان 8-16 درصد گزارش شده است(Saleh Gohari et al., 2005). مطالعات نشان داد که نوترکیبی همسان در باکتری , Vibrio Choleraeباعث ایجاد سویه های زنده ضعیف شده می گردد. ژنهای mer،ctxB،hlyAبواسطه نوترکیبی همسان دگرگون شده و باکتری های وحشی تبدیل به سویه های کاربردیCVD109 گردیدند. در این پروسه توالیهای یکسان انتهایی با طولهای متفاوت 100،500،1000 نوکلئوتیدی بررسی شده (Michalski et al.,1993). نهایتا مقالات و گزارشات نشان می دهد که هر چه میزان بیان ژن recA بیشتر باشد، بازدهی نوترکیبی همسان نیز بیشتر خواهد بود. ولی نکته مهم این است که میزان بیان ژن recA در باکتری های متفاوت نیزاختلاف نسبتا جزئی دارد، بنابراین ارزیابی و سنجش بیان ژن recA در بهبود و افزایش بازدهی نوترکیبی همسان مفید واقع خواهد شد و برهمگان واضح است که فرایند نوترکیبی همسان برای ایجاد واکسن و سویه های زنده ضعیف شده و همچنین ارزیابی ژنهای کنترلی مفید خواهد بود. 1-4 تعریف PCR[14] اين تکنیک در اواسط دههی 1980 بوسيله ی کری موليس معرفی شد. به دليل کاربردها و مزيتهای بسيار زياد آن به سرعت در زيست شناسی مولکولی گسترش پيدا کرد. امروزه اين روش تقريباً در تمامی آزمايشگاهها ی زيست مولکولی جزو کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتيک بوسيلهی کامپيوتر انجام می شود.اين تکنيک تمامی مشکلات قبلی در زيست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادير زياد از DNA يکسان بود را برطرف کرد. برای مثال قبلاً برای بدست آوردن نسخههای متعدد از يک ژن خاص می بايست اين ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در يک باکتری تکثير کنند ولی امروزه اين کار را به سادگی و با استفاده از PCRانجام می دهند.PCR به معنی واکنش زنجیره ای پلی مراز می باشد. هدف از آن سنتز رشته هایDNA جدید از روی رشته های الگو است که به صورت زنجیر وار تکرار میشود. PCR دارای انواع متعددی می باشد که یکی از آنها Real TimePCRاست. دراین روش از ژل آگارز استفاده نمی شود و امروزه با دستگاه های به نام لایت سایکلر[15] که مقدار محصول در هر سیکل را نمایش می دهد بسیار ساده شده است. در ساده ترین حالت از اتیدیوم بروماید[16] به عنوان رنگ تداخلی با DNAبرای تعیین مقدار محصو ل تولید شده در هرسیکل می توان استفاده کرد. ازآنجایی که قابلیت فلورسانس اتیدیوم بروماید در حضور DNA دورشته ای افزایش می یابد، می توان از آن برای تشخیص وتعیین مقدارمحصول دورشته ای استفاده کرد. اتیدیوم بروماید تقریبا هیچ گونه اثری برروی مقدارو خصوصیات واکنش های PCR، ندارد بنابراین تکثیر توالی های خاصDNAوتشخیص همزمان آن با دستگاه ترانس ایلومیناتور فرابنفش[17] امکان پذیر می گردد. PCR از نظر اصول عملی تشابه زيادی به همانند سازی DNAدارد و در واقع برگرفته از آن است . ياد آوری می شود که DNAپليمراز DNAتک رشته ای را از جهت 5َ به 3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد ورشته مکمل را در جهت5َبه 3َمی سازد. همچنين DNAپليمراز برای شروع احتياج به يک قطعه اوليه (شناساگر) دارد. برای انجام PCR ،DNAپليمراز ، نوکلئوتيد تری فسفات ها و پرايمر لازم هستند. از آنجائيکه DNAدو رشته ای است، دو نوع پرايمر درPCRموردنياز است. اين دو پرايمر دو عمل انجام می دهند، اول اينکه محل ژنی که بايد تکثير شود را مشخص می نمايند و دوم اينکه اندازه ی قطعات تکثير شونده را تعيين می کنند . عمل اول کاملاَ مشخص است، در مورد عمل دوم بايد گفت که وقتی اين دو شناساگر به دو ناحيهی مختلف DNAو به سمت هم قرار میگيرند DNAپليمراز تنها قطعات را در بين اين دو ناحيه همانندسازی میکند و به اين ترتيب طول قطعات ساخته شده تعيين میشود. برای شروع PCR ، DNAالگو، پرايمر ها و نوکلئوتيد تری فسفات ها و DNAپليمراز در يک لوله با هم مخلوط می شوند. سپس لوله را گرم می کنند تا دو رشته DNAاز هم جدا شوند. سپس لوله را سرد می کنند تا پرايمر ها به نواحی مورد نظر متصل شوند و DNAپليمراز شروع به همانند سازی از روی DNAبنمايد. بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی بار ديگر پرايمرها به نواحی مکمل خود متصل شوند. چون در مرحله ی قبل رشته DNAدر ناحيه مورد نظر مضاعف شده است، در اين مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد و در نتيجه در پايان اين مرحله بوجود مي آيد، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همين صورت بطور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زياد می شود . در ابتدای طراحی PCR از آنزيم DNAپليمراز E.coliاستفاده شد ولی اين آنزيم به حرارت حساس می باشد و بنابراين پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دمای 94 درجهی سانتیگراد، افزودن دوبارهی آنزيم تازه به محيط لازم بود. يکی از مهمترين کشفيات در اين زمينه اين بود که باکتريهای چشمههای آب گرم دارای DNAپليمراز هايی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعاليت بهتری دارند . برای مثال باکتری Thermus aquaticus دارای DNAپليمرازی است که در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پايدار است و همچنين دمای اپتيمم عمل آن نيز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد، اين DNAپليمراز که بطور خلاصه Taqپليمراز ناميده می شود باعث شد که براحتی PCRبه صورت اتوماتيک انجام شود و با افزودن يکبار آنزيم Taqپليمراز ديگر نيازی به اضافه کردن مجدد آن نباشد . مزيت بسيار مهم ديگر Taqپليمراز افزايش حساسيت و دقت PCRمی باشد. در دمای پايين (30 درجه سانتیگراد) (که برای DNAپليمراز E.coliبکار میرفت) پرايمرها ممکن است به جايگاههايی که توالی تا حدودی مشابه دارند نيز متصل شوند، زيرا در دمای پايين تعداد کمتری پيوند هيدروژنی برای اتصال پرايمرها نياز است. بنابراين پرايمرها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه، باعث ايجاد اشتباه در انجام مراحل PCRمیشوند. ولی وقتی که واکنش در دمای 72 درجه (دمای اپتيمم فعاليت Taqپليمراز) انجام شود اتصال پرايمر ها به نواحی غير از ناحِيهی اصلی کاهش میيابد. به اين صورت پس از پايان PCR رشته های DNAکاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد. برای ديدن قطعات تکثير شده DNAمیتوان براحتی از الکتروفورز برای ژل آگاروز و رنگ اميزی اتيديوم برومايد استفاده کرد . شکل(1-3) پروسه PC 1-4-1 کاربردهای PCR: تکنيک PCRکاربردهای نا محدودی در عرصه های مختلف زيست مولکولی دارد ، علت اصلی اين امر اين است که DNAالگوی بکار رفته در PCRرا میتوان از منابع مختلف تامين کرده و مورد استفاده قرار داد. بطور کلی PCR به منظور تهيه ی نسخه های متعدد از يک ژن و بررسی حضور يا عدم حضور يک ژن خاص در يک قطعه DNAبکار می رود . 1-4-2 تهيهی نسخه های متعدد از يک ژن برای اين کار بجای اينکه هر دو پرايمر مورد نياز برای PCRرا به يک ميزان به محيط واکنش اضافه کنند، يکی از پرايمرها را به تعداد کمتر پرايمر ديگر را به تعداد بيشتر اضافه می کنند. در هنگام انجام PCR، در ابتدا هر دو رشته با هم همانند سازی می کنند ولی پس از تمام شدن يکی از پرايمر ها فقط رشته ديگر که هنوز پرايمر آن وجود دارد ساخته می شود و به همين دليل نسخه های بيشتری از اين رشته بوجود می آيد. پس از پايان PCRچند نسخه DNAدو رشته ای از ژن مورد نظر ايجاد خواهد. مثال ديگری از کاربردهایPCRبررسی پيوستگی ژنها و تعيين فاصله ی بين ژنها بر روی کروموزومهای انسان است. در ژنتيک برای تعيين فاصله ی بين ژنها از بررسی تعداد نوترکيبها به نسبت فنوتيپ والدين استفاده می شود. اين روش برای مگس سرکه که زادآوری آن در هر نسل بسيار زياد و دوره ی رشد آن نيز کوتاه است به راحتی قابل انجام است ولی در مورد انسان که زاده های آن در هر نسل بسيار محدود و با فاصله ی زمانی زياد می باشد، اين بررسی هابه سختی و با محدوديت بسيار انجام می گيرد. ولی امروزه دانشمندان با استفاده از PCRروش جديدی را برای اين کار پيدا کرده اند. 1-4-3 مراحل آزمایشگاهی PCR: 1- واسرشت سازی دو رشته DNA: دراین مرحله DNAدو رشته ای در درجه حرارت بالا(حدود ۹۵ درجه) به منظور به دست اوردن مولکول های DNAتک رشته ای، واسرشت می شود. ۲- هیبریداسیون: در این مرحله توسط پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی که مکمل توالی DNAتک رشتهای شده هدف می باشند در درجه حرارت حدود ۴۰ تا ۶۵ درجه هیبریداسیون صورت می گیرد. ۳- طویل سازی (بسط یا سنتز): در این مرحله با یک DNAپلیمراز مقاوم به حرارت مانند Taqپلیمر از در درجه حرارت حدود ۷۲ درجه سانتیگراد طویل سازی رشته صورت می پذیرد. این مراحل پیدرپی تکرار می شوند به طوری که تعداد قطعات DNAدر هر سیکل دو برابر میشوند.به قطعاتی که در هر سیکل به صورت تصاعدی افزایش می یابند آمپلیکون[18] می گویند. 1-5 Real-Time PCR به علت ورود نسلجدیدی از ترموسایکلرها با سیستم فلورومتری که اجازه پایش پیوسته خاصیتفلوئورسانسمحصول PCR در زمان جمع شدن را می دهد، این روش ابداع شد. در این روش از کاوشگرهایا پروب های هیبریداسیون نشان دار شده با رنگ های فلورسانس در انتهای ّ5 یا ّ3 استفاده می شود. که امکان پایش پیوسته محصول PCR را بدون جداسازی آنها در روش ها یا الکتروفورز در ژل آگاروز یا ژل پلی آکریل آمید می دهد. این سیستم در سال 1992 کشف شد.در این روش به دلیل کاهش زمان سیکل های PCR، سرعت کار نسبت به سیستم PCR معمولی بیشتر است. سازندگان و کاربران این روش سعی می کنندمحصول PCR کوچک تر طراحی کنند تا سرعت افزایش یابد اما تجربه نشان داده که کاهش اندازه محصول لزوماً بازده PCR را بهینه نمی کند. البته این روش دارای معایبی نیزاست از جمله می توان به عدم ناتوانی در مشخص کردن اندازه محصول بدون باز کردن سیستم و ناسازگار بودن برخی پلت فرم ها با شیمی برخی رنگ های فلورژنیک اشاره کرد. برای شناسایی بسیاری از ویروس های عامل بیماری های انسان از این روش استفاده شده است. درReal Time PCR میزان محصولدر هر چرخه قابل ردیابی است و امکان بررسی و آنالیز چند رونوشت متفاوت در یک تیوپ امکانپذیر است. حساسیت و دامنۀ دینامیکی آن 1000 برابرPCR است؛ به کمک این تکنیک می توان ارزش گذاری کمی انجام داده و میزان الگوی اولیه را دقیقاً تخمین زد. تفاوت Real Time PCRبا PCR معمولی در این است کهReal Time PCR توانایی تشخیص در مراحل اولیه واکنش یعنی مرحله نمایی را دارد در حالی که در روش PCRمعمولی از ژل الکتروفورز در مراحل پایانی یعنی مرحله پلائو واکنش استفاده می شود. 1-5-1 کاربردهای Real Time PCR 1- تحقیقات در مورد میزان بیان .mRNA۲- اندازهگیری میزان همانندسازی DNAدر ژنوم یا DNAهای ویروسی. ۳- میزان تأثیر دارو درمانی. ۴- سنجش آسیبهای DNA 5- تشخیص عوامل بیماریزا. ۶- تعیین ژنوتیپ افراد. ۷-سنجش تفکیک شدن آللی. 1-5-2 اصول کارReal Time PCR تمامی اصول و واکنش گرهایی که برای یکRT-PCR معمولی نیاز است دراین تکنیک هم بکار می رود اما یکگزارشگرفلورسنتنیز در واکنش حضور دارد. این گزارشگرها به گونه ای طراحی می شوند که در صورت تکثیر DNAنور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. با ادامه یافتن PCRشدت فلورسنت رو به افزایش می گذارد. به اولین چرخه ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه باشد چرخۀ آستانه گویند. عدد CTبا مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی دار دارد و از روی آن می توان مقدار mRNAاولیه را تخمین زد. به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانهای می رسد که به مقدار مشخصی از سطح background بالاتر است، این چرخه (سیکلی از PCRکه قطعه تکثیر از حد آستانه عبور می کند) به عنوان CTشناخته می شود که دربرخی منابع با عنوان Crossing Pointمطرح شده است. این مرحله شروع نسخه برداری از قالب است که در محاسبات نتایج آزمایش استفاده میشود. 1-5-3روش کار Real Time PCR در این روش از یک مولکول گزارشگر[19] فلوروسنت برای مشاهده پیشرفت PCRبه کار میرود. فلوروسنت از مولکول گزارشگر ساطع میشود که تولیدات را چند برابر میکند. بر مبنای ملکولی که برای تشخیص استفاده میشود. در تشخیص غیر اختصاصی با استفاده از رنگهای باند شده بهDNAبه عنوان گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده واکنش PCR استفاده میشود. این فلوروسنت در سیکل متوالی بر اثر مضاعف شدن افزایش می یابد. با ثبت مقدار فلوروسنت ساطع شده در سیکل، می توان واکنش را در طول مرحله نمایی مشاهده نمود. اگر نموداری میان لگاریتم مقدار شروع واکنش و افزایش فلوروسنت گزارشگر ترسیم شود یک رابطه خطی مشاهده خواهد شد. اغلب از SYBRGreen به همراه DNAدو رشته ای به عنوان رنگ مخصوص گزارشگر استفاده می شود. این رنگ به شکاف کوچک از مارپیچ دو رشته ای DNAباند می شود. در داخل محلول, رنگهایی که باند نشده اند فلوروسنت خیلی کمی را نشان میدهند و فلوروسنت زمانی به وضوح افزایش میبابد که رنگ به DNAدو رشته ای پیوسته شود. SYBRGreenتحت شرایط PCRپایدار وبا ثبات باقی می ماند. سطح مطلوبی از درجه حرارت موجب تنظیم القاء و نشر طول موج ها می شود. همان طور که پیشتر ذکر شد از اتیدیوم بروماید نیز برای تشخیص می توان استفاده کرد ولی به علت سرطان زا بودن ان کمتر استفاده می شود. در طراحی پرایمر، نکاتی جهت انجام واکنش Real-Time PCRدر نظر گرفته شد که شامل: - طول محصول 200-75باز - اختلاف Tmدر هر دوجفت پرایمر حداکثر 5/0 درجه سانتیگراد باشد. - داشتن خصوصیات لازم در سایر پرایمرهای معمولی 1-5-4 آنالیزهای کمی در Real time PCR دو روش عمده برای بررسی کمی در Real time PCRوجود دارد 1-5-5 روش منحنی استاندارد(مقایسه مطلق) در این روش از نمونه RNAیا DNAبا غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده می شود. غلظت RNAیا DNAاستاندارد با اسپکتروفوتومتر (260nm) تعیین میشود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه های آن تبدیل می شود.استانداردهای غلظتی ژنهای معروف به صورت تجاری قابل خریداری است. برای حذف نوسانات مقادیر RNAوارد شده در واکنش و خطاهای عملکرد دستگاه ها و فرد از استاندارد های داخلی استفاده می شود.به این ژن ها Housekeepingگویند. علاوه بر برپایی PCRبا پرایمر اختصاصی ژن برای هر نمونه یک PCRهمزمان با پرایمر بتااکتین یا GAPDHهم انجام می شود و دادههای هر نمونه با ژن Housekeepingهمان نمونه نرمالیز می شود. سپس با استفاده از نمونه استاندارد می توان به نمونه مجهول پی برد. 1-5-6 روش آستانه نسبی(مقایسه نسبی) در این روش نیازی به رسم منحنی استاندارد نیست. و مقدار نرمالیز شدهCTنسبت به یک نمونه تیمار نشده سنجیده می شود. در این روش نیز به استاندارد های داخلی نیازمندیم.و باید مقدار CTآن ها از مقدار CTنمونه مورد نظر کسر گردد (نرمالیز کردن). تفاوت نسبی نمونه آزمایش در مقابل کنترل محاسبه می شود. CTعبارتست از C ژن هدف (کالیبراتور) که از C ژن Housekeepin کسر شده است. شکل( 1-4) منحنی PCR 1-6E.coli Escherichia coliکه بطور اختصار E.coli نیز نامیده می شود، نوعی باسیل گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه است که بطور شایع در روده جانوران خونگرم وجود دارد. بیشتر سویه های E.coli، بی آزار هستند اما برخی از سروتیپ ها موجب مسمویت غذایی و اسهال می شوند(مرکز جهان[20]CDC). این سویه های بی آزار، بخشی از فلور عادی روده هستند. آن ها در تولید ویتامین K وBنقش دارند و از استقرار باکتری های بیماریزا در روده جلوگیری می کنند. این باکتری، 1/0% فلور روده را به خود اختصاص داده است. این باکتری از طریق مسیر مدفوعی-دهانی[21] از یک فرد به فرد دیگر منتقل می شود. 1-6-1 خصوصیات عمومی هر گرم از مدفوع انسان حاوی بیش از 108باکتری E.coliمی باشد.c. E.coliبه خوبی روی محیط های خیلی ساده رشد می کند، و متحرک می باشد. لاکتوز را تخمیر می کند و درخشندگی سبزرنگی روی محیط EMB(جلای فلزی) تشکیل می دهد. این باکتری دارای فعالیت لیزین دکربوکسیلاز[22]بوده و می تواند استات را به عنوان تنها منبع کربن استفاده نماید و قادر به هیدرولیز تریپتوفان می باشد. این باکتری[23]MUGمثبت است. این باکتری پس از 10 دقیقه در 70°Cاز بین می رود. نسبت به مقادیر زیاد املاح صفراوی ـ سلینت F حساس است. رنگ های مالاشیت گرین و بریلیانت گرین از رشد این باکتری جلوگیری کرده و از این مواد برای تهیه محیط های انتخابی پاتوژن ها استفاده می گردد. E.coliبه عنوان یک پاتوژن کلیدی در عفونت های بیمارستانی مطرح است و هم چنین عامل ایجاد کننده عفونت های مجاری ادارای کسب شده از جامعه نیز می باشد. 1-6-2 تقسیم های دوتایی و پیاپی E.coli E.coli، باسیل گرم منفی، متحرک و بی هوازی اختیاری و بدون اسپور است. این باکتری در شرایط بی هوازی، مخلوطی از اسیدها مانند لاکتات، سوکسینات، اتانول، استات و دی اکسید کربن را تولید می کند رشد بهینه باکتری در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد است اما تا دمای ۴۹ درجه را نیز تحمل کرده و به رشد خود ادامه می دهند (Fotadar et al., 2005).E.coli، هم در شرایط هوازی و هم بی هوازی می تواند رشد کند. سویه ها دارای تاژک هستند و به خاطر همین، متحرک هستند. تاژه ها متعدد و از نوع پیرامونی[24] هستند (Darnton et al., 2007). E.coliو باکتری های مشابه آن، با استفاده از مکانیسم هایی مانند ترانسفورماسیون، هم یوغی(کانژوگاسیون) و ترانسداکسیون، ماده ژنتیکی خود را از راه انتقال افقی ژن ها به سایر باکتری های مشابه خود منتقل می کنند. به عنوان مثال، انتقال ژن توکسین شیگا از ShigellaبهE.coli O157:H7از طریق فاژ (ترانسداکسیون) اتفاق افتاده است (Brussow 2004). 1-6-3 کاربردها E.coliنخستین جانداری بود که باروش های مهندسی ژنتیک مورد دستکاری ژنتیکی قرار گرفت. از E.coliبرای کلونینگ[25]و بیان بسیاری از ژن ها و تولید محصولات نوترکیب استفاده شده است به عنوان مثال، با استفاده از مهندسی ژنتیک، دانشمندان توانسته اند از E.coli، انسولین تولید کنند. همچنین از E.coli های تغییر یافته برای تولید واکسن و زیست پالایی نیز استفاده شده است (Comelis etal., 2000). از E.coliبه عنوان یک ارگانیسم مدل در پژوهش های ژنتیکی استفاده می شود. به عنوان مثال، اولین بار پدیده هم یوغی(کانژوگاسیون)در آن دیده شد و هنوز هم در تحقیقات از آن استفاده می شود (Lederberg 1946) برای بررسی اثرات فاژ بر باکتری ها، اولین بار از E.coliاستفاده شد. 1-6-4 تشخیص آزمایشگاهی باکتری E.coli E.coliبر روی محیط آگار مک کانکی[26]، کلنی های ارغوانی ایجاد می کند زیرا باکتری از نوع لاکتوز مثبت است و قند را تخمیر کرده و اسید تولید می کند. اسید موجب کاهش pHدر محیط آگار مک کانکی شده و در نتیجه رنگ ارغوانی ایجاد می شود. همین اتفاق نیز در محیط EMB[27] رخ داده و کلنی های ارغوانی تیره با جلای سبز فلزی ایجاد می کند. باکتری در محیط [28]TSIبه صورت اسید/اسید و با تولید گاز و H2Sمنفی است. برای بررسی وجود توکسین می توان از کشت سلولی یا PCR(واکنش زنجیره ای پلیمراز) استفاده کرد (Paton et al., 1998). 1-7 Shigella باسیلهای گرم منفی و غیر متحرکی هستند که قرابت نزدیکی باE.coli و Salmonellaدارند. Shigellaفقط در انسان و نخستی سانان بیماریزا است اما در سایر جانوران بیماریزا نیست.Shigella موجب اسهال خونی (دیسانتری) می شود. باکتری اولین بار توسط میکروب شناس ژاپنی به نام کیوشی شیگا در سال ۱۸۹۸ کشف شد. مطالعات فیلوژنتیکی نشان می دهد که شیگلا، زیرگونه ای از E.coli است. پس از تهاجم به روده، باکتری در سلول های روده تکثیر پیدا می کند و موجب آسیب به بافت روده میشود. باکتری های جنس Shigellaعضوی از خانواده بزرگ باکتری های روده ای یعنی انتروباکتریاسه می باشند . این باکتری گرم منفیاست که برخی گونه های آن مانندdysentrieae Shigellaباعث نوعی اسهال بنام شیگلوز می شوند Shigellaبه صورت باسیلهای گرم منفی هستند که فاقد اسپورو کپسول وبدون حرکت می باشد. این باکتریها هوازی و بی هوازی اختیاری اند. گلوکزرا تخمیرمی کنند اما لاکتوزرا نمی توانند تخمیر کنند. 1-7-1 تشخیص آزمایشگاهی باکتری Shigella Shigellaاز لحاظ حرکت، منفی است و لاکتوز را تخمیر نمی کند اما S.Sonnei، لاکتوز را تخمیر میکند. آنها گاز تولید نمیکنند (به استثنای برخی از سویه هایS. Flexneri). هیدرولیز اوره در باکتری، منفی است. در محیط [29]TSI، گاز منفی و H2S(سولفید هیدروژن) منفی خود را نشان میدهد. واکنش اندول ممکن است مثبت یا منفی باشد. بر روی محیط هکتون انتریک آگار، کلنیهای آبی- سبز تولید میکند اما سالمونلا، کلنیهای آبی- سبز با مرکز سیاه تولید میکنند (Ito et al., 1991). 1-7-2 بیماری زایی Shigellaاز طریق خوردن و آشامیدن منتقل می شود. کمتر از ۱۰۰ باکتری برای ایجاد اسهال کافی است. اسهال خونی بر اثر تخریب لایه مخاطی راست روده (روده بزرگ) اتفاق می افتد.برخی از سویه ها، انتروتوکسین و شیگاتوکسین تولید می کنند. شیگاتوکسین شبیه وروتوکسین E. coli O157:H7است. هر دو نوع توکسین موجب بروز علائم همولیتیک اورمیک می شوند. شیگلا از طریق سلول های M، روده را مورد تهاجم قرار می دهد زیرا توانایی حمله به سلول های اپتلیالی روده را ندارد. علائم بیماری شامل تب، اسهال، استفراغ و باد نفخ است.مدفوع ممکن است دارای خون، موکوس و چرک باشد. علائم بطور معمولا، یک هفته پس از بلع باکتری، خود را نشان می دهند. Shigellaدارای یک پلاسمید ویرولانس است که بسیاری از شاخص های بیماریزایی بر روی آن قرار گرفته است. بدلیل خسارتهای بهداشتی که این باکتری به سیستم پزشکی کشورهای در حال توسعه وارد میکند فعالیت های علمی زیادی برای تولید واکسن بر علیه این باکتــری در جریان است (Hill Gaston et al., 2003).dysentrieae Shigellaتیپ یکعامل بیمـاری زای روده است کـه توان بیماری زایی فوق العاده ای دارد و از عوامل اصلی بروز دیسانتری همه گیرو یا بومی با مرگ ومیر زیاد به حساب می آید؛ همچنین، تنها علت همه گیری های اسهال خونی در ابعاد وسیع در مناطق مختلف دنیاست. در سال های اخیر، همه گیری های وسیع بیماری در امریکای مرکزی، جنوب آسیا، آفریقای جنوبی و مرکزی گزارش شده است. 1-8Vibrio Cholerae Vibrio Choleraeنام باکتری مولد وبا است. گونه Vibrio Cholerae، از جنسVibrio و از خانواده ویبریوناسه است. Vibrio باکتری های گرم منفی و دارای تاژک هستند. معمولاً در آب دریاها و آب شیرین یافت می شود.. این جنس جزء خانواده ویبریوناسه است. این جنس بیش از ۶۰ گونه مختلف دارد که سه گونه آن بیماری زاتر از بقیه هستند: - ویبریو کلرا (V.cholera) - ویبریو پاراهمولیتیکوس(V. parahaemolyticus) - ویبریو ولنیفیکوس (V.vulnificus) خانواده ويبريوناسه شامل باسيل هاي گرم منفي، خميده، متحرك و داراي يك تاژك قطبي هستند و بخاطر اكسيداز مثبت بودن، از خانواده انتروباكترياسه متمايز مي گردند. اين ارگانيزم ها در آب دريا و سطحي يافت مي شوند. مهمترين گونه اين خانواده ويبريوكلرا است كه عامل بيماري اسهال وبائي پاندميك و اپيدميك محسوب مي گردد. علامت اصلي بيماري وبا، اسهال و كم آبي شديد، توقف جريان خون كاهش ادرار بوده و مشخصه اصلي اسهال وبائي، مدفوع آب برنجي است. ویبریو کلرا O1 به بیوتیپ های التور )نام سویه ای از باکتریویبریو کلرااست.ویبریو کلرا عامل بیماری وبااست این سویه باعث نوعی از بیماری شبه وبا می شودسویه بسیار شبیه زیر گونهO1ویبریو کلرا است. ولی می تواند گلبول های قرمز خون را منهدم کنند.)و کلرا (با بیوتیپ کلاسیک) تقسیم می شود. برای اولین بار این تقسیم بندی بر مبنای همولیز گلبول های قرمز به توسط بیوتیپ التور پایهگذاری شده است. 1-8-1 شناسایی و طبقهبندی بر طبق کتاب طبقهبندی سیستماتیک برگی[30] گونه Vibrio Choleraeباكتري گرم منفي، متحرك، مزوفيليك و كموارگانوتروف ميباشند. داراي متابوليسم هوازي اختياري بوده ودر محيط هاي آبي يافت مي شوند. آنها قادر به رشد روي محيط انتخابي TCBS[31] بوده و اكسيداز مثبت ميباشند. اغلب Vibrio ها در محيط هاي آبي مانند دهانه رودخانهها، آبهاي ساحلي و رسوبات ساحلي در سراسر دنيا به ميزان زيادي يافت مي شوند. مطالعات نشان داده اند كه حتي مقادير زيادي از ويبريوها در ارگانيسمهاي دريايي مثل ماهي ها، حلزون ها، صدف ها، ميگوها و زوپلانكتون ها ميتوانند وجود داشته باشند. جنس Vibrio متعلق به خانواده ويبريوناسه بوده و 28 گونه آن شناسايي شده است.هیبرگ[32]، Vibrioرا از روي تخمير قندهاي سوكروز، آرابينوز و مالتوز به 6 گروه تقسيم كرده است كه امروزه به 8 گروه رسيده است که ویبریو کلرا, عامل بيماري وبا، متعلق به گروه اول هیبرگ مي باشد. سازمان بهداشت جهاني [33]WHOدر سال 1980 Vibrio Choleraeرا به 4 گروه تقسيم نمود: 1) Vibrio Choleraeكه داراي آنتي ژن O1هستند و ايجاد وباي آسيايي مي كنند و آن را Vibrio CholeraeO1مي نامند، اين باكتريها قادر به ترشح توكسين بوده و ايجاد بيماري ميكنند. 2) Vibrio Choleraeكه داراي آنتي ژن O1هستند ولي توكسين توليد نمي كنند و بيماريزا نيستند كه به آنها Vibrio Choleraeآتیپیک ميگويند. 3) Vibrio Choleraeكه از نظر شكل، خصوصيات بيوشيميايي و ژنتيكي شبيه به انواع اپيدميك بوده ولي با آنتي سرم O1آگلوتينه نميشوند كه آنها را غير قابل Vibrio Choleraeآگلوتيناسيون[34] مينامند. 4) Vibrioديگر مانند Parahemolyticus، Alginolyticusو غيره كه گونههاي مشخص ميباشند. با توجه به تشخيص 206 سروتایپ ازVibrio Cholerae، تنها سروتایپ هاي O1و O139بعنوان عوامل ايجاد كلراي اپيدميك و پاندميك شناخته شده است. 1-8-2 فیزیولوژی صفات کشت و بیو شیمیایی: Vibrio Choleraeیک ارگانیسم اختیاری است که در درجه حرارت اپتیمم رشد آن از 18 تا 38 درجه سانتیگراد متغیر است.متابولیسم آن از طریق تنفسی و تخمیری میباشد.Vibrio Cholerae بر روی تنوع وسیعی از محیطهای ساده با یک منبع کربوهیدرات، نیتروژن معدنی، گوگرد، سولفور،فسفر، مواد معدنی وبافر رشد میکند. Vibrio Choleraeبه خوبی درpH= 7رشد میکند اما در شرایط قلیایی تا 9pH=را تحمل می نماید. از این ویژگی برای طراحی محیط های جداسازی وبا استفاده میشود. Vibrio Cholerae در برابرphاسیدی به شدت حساس است و pH= 6 محیطهای کشت را استریل خواهد کرد. 1-8-3عوامل موثر در بیماری زایی انتروتوکسین: یک انتروتوکسین قدرتمند خارج سلولی که بر روی سلولهای رودهی کوچک ثاثیر میکند، فاکتور بزرگ بیماری زایی است که توسطVibrio Cholerae تولید میشود. این توکسین در میان بسیاری از توکسین های مشابه اولین توکسینی بود که کشف شد.این توکسین از نظر ساختمانی و عمل کرد، ارتباط بسیار نزدیکی با توکسین حساس به حرارت اشریشیاکلی دارد. توکسین وبا یا کلرا ژن یک ملکول پروتئینی پیچیده با وزن تقریبی 000/84 دالتون می باشد. چسبندگی:Vibrio Cholerae بیماری زا باید از طریق اتصال به روده در دستگاه گوارش استقرار یابد مطالعاتی که بر روی چسبندگی انجام شده نشان داده است که سلولهایی با قدرت بیماری زایی باید در مخاط روده نفوذ نموده و به میکروویلی های حاشیه مسواکی سلولهای اپیتلیال اتصال یابند.تحریک ارگانیسم ها ممکن است در چسبندگیVibrio Cholerae شرکت داشته باشد لذا سوشهای توکسین زا توانایی ابتلا به بیماری را ندارد. 1-8-4 تأیید بیوشیمیایی تستهای بیوشیمیایی برای تشخیص سویه های Vibrio Choleraeبکار می روند. این تستها حتی قبل از بررسی سویه ها با آنتی سرم یا انجام تستهای ژنتیکی بکار می روند. از جمله مهمترین این تستها عبارتند از: 1-8-4-1 واکنش بر روی محیط TS [35] یا KIA[36] از جمله محیطهای حاوی کربوهیدرات هستند که معمولا" برای بررسی باکتریهای بیماریزا روده ای بکار می روند. 1-8-4-2 تستهای دکربوکسیلاز-دهیدرولاز Vibrio Choleraeمعمولاً واکنش منفی آرژینین دهیدرولاز ایجاد میکند (Giono-Cerezo et al., 1994). 1-8-4-3 تست نیاز به نمک برای رشد بسیاری از گونههای Vibrio هالوفیل می باشند و برای رشد نیاز به افزودن NaCl دارند. 1-8-4-4 حساسیت به ترکیب ویبریواستاتیک [37]129/O حساسیت به این ترکیب یکی از ویژگیهای قابل توجه جنسVibrio است. این تست میتواند بعنوان یکی از اولین روشها برای تمایز Vibrio از آئروموناسها می باشد. 1-9 رشد و نمو باکتریها رشد و نمو باکتری شامل افزایش تمامی مواد شیمیایی تشکیل دهنده و نیز تمایز آن است. رشد و نمو باکتری از دو راه حاصل میشود،1. بزرگ شدن اندازهی سلول قبل از اینکه تقسیم شود. به این معنی که هر سلول جدید ابتدا حدود دو برابر اندازه طبیعی خود بزرگ و سپس تقسیم میشود 2. افزایش تعداد سلولها (تکثیر) که معمولا بر اثر تقسیم دوتایی حاصل میشود. تقسیم دوتایی نتیجهی بزرگ شدن بیش از اندازه ی سلول است. تقسیم سلول باکتری شامل دو مرحله است: تقسیم هسته و تقسیم سلول کامل. ابتدا هسته یا کروموزوم از طریق طولی به دو قسمت کروماتینی کاملا مساوی تقسیم میشود که یکی نسخهی دیگری است. هر یک از این دو قسمت به یک طرف سلول میرود. همزمان با همانندسازی کروموزوم، یک فرورفتگی در غشای سلول در محل مزوزوم پدید میآید. در این محل آنزیمهای اتولیزین ترشح میشوند. این آنزیمها بر روی پپتیدوگلیکان دیواره سلولی اثر میگذارند و باعث هیدرولیز آن میشوند. سپس فرورفتگیهای غشا عمیقتر میشود و از دو سمت سیتوپلاسم به هم میرسد. بدین ترتیب دو قسمت سلول از هم جدا میشوند و هر یک از سلولهای حاصل در سمت مشترک خود دیوارهی جدیدی را ترشح میکنند. 1-10زمان تقسیم سلولی متوسط زمان مورد نیاز برای دو برابر شدن جمعیت یا توده ی زنده ی باکتری ها به نام زمان تولید مثل یا زمان مضاعف شدن شناخته می شود. هر چه زمان تولید مثل طولانی تر باشد، سرعت رشد باکتری در محیط کشت کندتر می باشد. این زمان برای انواع باکتری ها متفاوت است. مثلا برای Mycobacterium tuberculosisحدود 15 تا 20 ساعت و برای E.coli20 تا 30 دقیقه است. 1-11 مراحل رشد و منحنی رشد باکتریها بر اساس نظریه ی کوهن اگر مانعی برای رشد باکتریها وجود نداشته باشد، یک باکتری با اندازه متوسط (طول 2 و عرض 1 میکرون) قادر خواهد بود در شرایط آزاد، حجمی به ظرفیت اقیانوس ها و دریاها را در مدت 5 روز پر کند. اما خوشبختانه رشد باکتری ها تحت تاثیر عوامل بسیاری مهار می شود. اگر باکتری های مشخصی را در یک محیط کشت مایع بسته کشت دهیم و این محیط حاوی مواد غذایی مناسب و گاز های مورد نیاز باکتری باشد، سرعت رشد و تکثیر باکتری ها در زمان های مختلف از الگوی منحنی شکل 2-2 تبعیت می کند. محور طولی این منحنی زمان و محور عرضی آن لگاریتم تعداد باکتری زنده را نشان می دهد. این منحنی نشان می دهد که الگوی رشد باکتری ها در یک محیط کشت بسته شامل چهار مرحله است. 1-12منحني رشد باكتريايي درآزمايشگاه، تحت شرايط مناسب، يك جمعيت باكتريايي در حال رشد در فواصل منظم دو برابر مي گردد. رشد با تصاعد هندسي صورت مي پذيرد: 1، 2، 4، 8، و ... يا 20، 21، 22، 23 ... n2 (n = تعداد نسل). اين رشد، رشد لگاريتمي ناميده مي شود. در واقع، رشد لگاريتمي (نمايي) تنها بخشي از چرخه حيات باكتريايي بوده و ارائه دهنده الگوي طبيعي رشد باكتري ها در طبيعت نيست.هنگامي كه يك محيط تازه با تعداد معلومي از سلول ها تلقيح گردد و رشد جمعيت در يك دوره زماني مورد بازبيني قرار گيرد، استقرار داده ها روي نقشه، يك منحني رشد را نتيجه خواهد داد. شكل (1-5)منحني رشد باكتريايي 1-12-1 مرحله ی خفته یا تاخیری (Lag phase) این مرحله با ورود باکتری ها به محیط کشت شروع می شود. در اوایل این مرحله باکتری ها فاقد قدرت تکثیر هستند و حد نمو آنها صفر است. در ادامه این مرحله، حد نمو و سرعت تکثیر آنها کم کم افزایش می یابد تا در پایان این مرحله به حداکثر می رسد. در این مرحله عملا متابولیت ها و گازهای زاید در محیط وجود ندارد. این مرحله تقریبا دو ساعت طول می کشد. 1-12-2 مرحله ی فعال تکثیر یا رشد و تکثیر لگاریتمی (Logphase) این مرحله بلافاصله از زمانی آغاز می شود که سرعت رشد به حداکثر و در عین حال به میزان ثابتی رسیده است. در این مرحله، بدون هیچ مانع آشکاری باکتری ها به طور آزاد تکثیر می یابند و زمان تولید مثل به کوتاهترین حد ممکن رسیده است. تراکم باکتری ها به طور تصاعدی افزایش می یابد و تمام آنها زنده هستند. متابولیت ها و گازهای زاید به حداقل میزان در محیط وجود دارند. 1-12-3 مرحله ی سکون یا تکثیر کند (Stationary phase) در ابتدای این مرحله میزان رشد به تدریج رو به نقصان می گذارد و افزایش تعداد باکتری ها دیگر به صورت تصاعدی نیست. زیرا زمان تولید مثل طولانی می شود و حد نمو رو به کاهش می رود تا به صفر برسد. عواملی که در پیدایش این مرحله دخالت دارند شامل کاهش یا فقدان مواد غذایی مورد نیاز در محیط کشت، تجمع متابولیت های سمی و همچنین کاهش میزان گاز های مورد نیاز باکتری است. در باکتری های هوازی هنگامی که غلظت باکتری از 107 باکتری در میلی لیتر افزایش نشان می دهد، حد نمو کاهش خواهد یافت. هنگامی که غلظت سلولی به 109× 5/4 باکتری در میلی لیتر برسد، با وجود وارد کردن هوا به طور مصنوعی، میزان نفوذ اکسیژن برای رفع نیاز های باکتری کافی نیست و به تدریج میزان نمو کند می شود و به صفر می رسد. 1-12-4 مرحله ی زوال یا مرگ (Deathphase) در این مرحله میزان مرگ و میر باکتری ها افزایش می یابد و از تراکم باکتری های زنده کاسته می شود. میزان رشد در این مرحله منفی است، به نحوی که به علت کمبود شدید مواد غذایی و گاز های مورد نیاز و همچنین افزایش متابولیت ها، قسمتی از باکتری ها اتولیز می شوند و مرگ این دسته به وسیلهی تولید سلول های جدید جبران نمی شود. 1-13سرعت رشد و زمان نسل سرعت هاي رشد باكتريايي در جريان فاز لگاريتمي، تحت شرايط تغذيه اي استاندارد (محيط كشت، دما، pH و غيره)، زمان نسل باكتري را معين مي كنند. زمان هاي نسل باكتري ها از حدود 12 دقيقه تا 24 ساعت يا بيشتر متفاوت است. زمان نسل براي E.coli در آزمايشگاه 20-15 دقيقه بوده، اما در دستگاه روده اي زمان نسل كولي فرم ها 12 تا 24 ساعت تخمين زده مي شود. براي اكثر باكتري هاي شناخته شده كه ميتوان آنها را كشت داد، گستره زمان نسل از حدود 15 دقيقه تا 1 ساعت است. همزيست ها نظير رايزوبيوم ها به زمان هاي نسل طولاني تري گرايش دارند. بسياري از ليتوتروف ها مانند باكتريهاي تثبيت كننده نيتروژن نيز از زمان هاي نسل طولاني برخوردارند. برخي باكتري هاي پاتوژن مانند مايكوباكتريوم توبركلوزيس و ترپونما پاليدوم، به طور ويژه زمان هاي نسل طولاني داشته اند 1- 14 محاسبه زمان نسل باکتری در هنگام رشد لگاريتمي، بر جمعيت باكتريايي به واسطه تقسيم دوتايي افزوده مي گردد. چنانچه با يك سلول شروع كنيم، هنگامي كه اين سلول تقسيم يابد، در نسل نخست، 2 سلول به وجود مي آيد، 4 سلول در نسل دوم، 8 سلول در نسل سوم، و غيره وجود خواهد داشت. زمان نسل فاصله زماني مورد نياز براي سلول ها (يا جمعيت) جهت تقسيم است. t= فاصله زماني بر حسب ساعت يا دقيقه B= تعداد باكتري ها در آغاز يك فاصله زماني b= تعداد باكتري ها در پايان فاصله زماني n= تعداد نسل ها (تعداد زمان هايي كه جمعيت سلولي در طي فاصله زماني دو برابر مي گردد 1-15 شيوههاي سنجش تعداد سلول تكنيكها شامل شمارش مستقيم، مشاهده يا به كارگيري ابزار، و شمارش غيرمستقيم سلول زنده است. الف- شمارش ميكروسكوپي مستقيم[38] با استفاده از لامهاي اختصاصي موسوم به اتاقكهاي شمارش[39]. در اين روش، سلول هاي مرده را نمي توان از سلول هاي زنده تشخيص داد.اما نمونه ها را مي توان جهت افزايش حساسيت، به كمك سانتريفيوژ يا فيلتراسيون تغليظ نمود. انواعي از شمارش ميكروسكوپي مستقيم براي مشاهده و سنجش رشد باكتريايي درمحيط هاي طبيعي مورد استفاده است. ب- اتاقك هاي شمارش الكتروني[40] تعداد سلولها را شمارش نموده و اندازه توزيع آنها را ميسنجند. اين قبيل ابزارهاي الكتروني غالباً براي شمارش سلولهاي يوكاريوتي نظير گلبول هاي خوني به كار ميروند. ج- شمارش غير مستقيم سلول زنده[41] ، كه همچنين شمارش كشت[42] ناميده مي شود. در اين روش، نمونه اي از يك كشت روي سطح يك پليت نوتريئنت آگار گسترانيده مي شود. اين نمونه يا سوسپانسيون سلولي را مي توان پيش از كشت در يك محلول غير سمي (مانند آب يا آب نمك) رقيق ساخت. اگر كشت بر روي يك محيط مناسب صورت گيرد، هر واحد زنده رشد كرده و يك كلني را پديد مي آورد. هر كلني كه بتوان آن را شمارش نمود يك واحد تشكيل دهنده كلني يا cfu[43] ناميده مي شود، و تعداد cfuها با تعداد زنده باكتري ها در نمونه متناسب است.مزيت اين تكنيك حساسيت آن بوده (از لحاظ تئوري، يك سلول منفرد مي تواند پي برده شود) و اينكه اجازه بررسي و شناسايي ارگانيسم را مي دهد. كاستيهاي اين روش عبارتند از : (1) تنها سلول هاي زنده اي كه قادر به ايجاد كلني هستند قابل شمارش مي باشند؛ (2) توده ها يا زنجيره هاي سلول ها به يك كلني توسعه پيدا نميكنند؛ (3) توسعه كلنيها صرفاً از ارگانيسمهايي صورت مي گيرد كه از شرايط كشتي مناسبي برخوردارند. از اين رو چنين تكنيكي جهت شمارش تعداد كل باكتري ها در اكوسيستم هاي پيچيده ميكروبي همچون خاك يا دستگاه گوارش حيوانات كارآيي ندارد. كاوشگر هاي ژنتيكي را مي توان براي اثبات تنوع و فراواني نسبي پروكاريوت ها در اين دست از محيط ها به كار برد، اما توسط تكنيك هاي ژنتيكي مي توان گونه هاي متعددي را شناسايي كرد كه از طريق كشت اثبات نمي گردند 1-16 محیطهای کشت: کشت وتکثیر باکتریها در محیط های مصنوعی از مهمترین روشهای تشخیصی در باکتری شناسی است . برای کشت موفق باید شرایط مناسب برای رشد باکتری فراهم گردد. ازجمله این شرایط مواد غذایی- حرارت- رطوبت کافی- نمک- pH مناسب- حضور یا عدم حضور اکسیژن میباشد. محیط های كشت را متناسب با نوع آزمایش میتوان به دو صورت مایع و جامد تهیه كرد. 1-16-1محیط كشت مایع: محیط های مایع به علت نداشتن آگار در تركیب خود به صورت جامد در نیامده و متناسب با نوع میكروارگانیسم و آزمایشهای موردنظر میتوان آنها را در لولههای آزمایش ـ ارلن مایر و یا ظروف دیگر مورد استفاده قرار داد. محيط LBغني از مواد مغذي ديگر مي باشد، كه جهت رشد بسياري از ميكروارگانيسم ها مي توان از آن استفاده نمود. اين محيط را مي توان به صورت آبگوشت ((LB Brothتهیه کرد. 1-16-2 محیط كشت جامد: محیطهای جامد به علت دارا بودن آگاردر تركیب خود به صورت جامد بوده و متناسب با میكروارگانیسم ها و آزمایش های موردنظر میتوان آنها را در لوله - ظروف پتری (پلیت) و یا ظروف دیگر مورد استفاده قرار داد . البته محیط های نیمه جامد نیز وجود دارد. که میزان آگار آن نسبت به محیط های جامد کمتر است. 1-17اهداف کلی بهینهسازی نوترکیبی همولوگ با استفاده از ارزیابی بیانژن l-Redدر باکتری های dysentrieaeShigella,E.coli, Vibrio Cholerae 1-18 اهداف اختصاصی 1- ارزیابی بیان ژن l-Red در سه میزبان مذکور. 2- بهینه سازی نوترکیبی همسان و تعیین تقریبی طول flankجهت انجام نوترکیبی همسان. نتایج این طرح میتواند بعنوان الگویی برای سایر محققین مورد استفاده قرار بگیرد و با اتکا به نتایج حاصله میتوان پروسه نوترکیبی همسانرا راحت تر و دقیقترانجام داد. 1-19 پرسشهاي تحقيق
[2] Transformation [3]Specialized transduction [4]Homologous Recombination [5]Recombination [6]low copy number [7]Temperature sensitive [8] Transformation [9]Bacterial Artificial Chromosome [10]P1 Artificial Chromosome [11] In vivo [12]Homologous Recombinantion [13]Polymerase chain reaction [14]Polymerase chain reaction [15]Lightcycler [16]EtBr [17]UV Transilominator [18] Ampelicon [20]CDC National Center [21]Oral- Fecal [22]LDC+ [23]متیل آمبلی فریل بتا گاما لاکتوزید [24]peritrichous [25]Clonning [26]MacConkey agar [27]Inosine metil blue agar [28]Triple sugar iron [29]Triple sugar iron [30]Bergeys Manual of Systematic Bacteriology [31]Thiosulfate Citrate Bile Salt agar [32]Heiberg [33]World Health Organization [34]NAG (Non-Agglutination) [35]Triple sugar Iron Agar [36]Kligler Iron Agar [37]2,4- Diamino-6,7- Di-isopropylpetridine [38] direct microscopic count [39] counting chambers [40] electronic counting chambers [41] indirect viable cell count [42] plate count [43] colony forming unit دریافت فایل جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید |